隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)是隱孢子蟲(Cryptosporidium)寄生于人類和動(dòng)物呼吸道或消化道上皮細(xì)胞刷狀緣納蟲空泡中,以腹瀉、脫水為主要臨床癥狀的寄生性原蟲病。隱孢子蟲可感染多種動(dòng)物,其中幼齡動(dòng)物最易感,是新生動(dòng)物腹瀉的病因之一。隱孢子蟲病已嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康,給畜牧業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,目前無有效的治療藥物,疫苗免疫是防控該病的新策略,因此,篩選免疫原性高的靶抗原具有相當(dāng)重要的意義。目前保定地區(qū)對(duì)微小隱孢子蟲相關(guān)研究較少,對(duì)重組蛋白CP23免疫特性進(jìn)行研究,為抗微小隱孢子蟲疫苗和免疫學(xué)診斷方法的研制提供了候選抗原,為隱孢子蟲病的防控奠定了基礎(chǔ)。本試驗(yàn)從河北保定地區(qū)分離得到奶牛源隱孢子蟲卵囊,通過PCR擴(kuò)增獲得18SrRNA全基因1188bp的片段,構(gòu)建pEASY-18SrRNA質(zhì)粒并測(cè)序,對(duì)測(cè)序序列應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行分析,結(jié)果表明分離到的蟲種為微小隱孢子蟲。將Cp23基因克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)中,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-Cp23。并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),通過SDS-PAGE結(jié)果顯示,表達(dá)蛋白分子量為25kDa,且為包涵體蛋...

【文章頁數(shù)】：75 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 隱孢子蟲概述
        1.1.1 病原學(xué)研究
        1.1.2 生活史
        1.1.3 流行特點(diǎn)
        1.1.4 表面粘附蛋白
        1.1.5 實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)
        1.1.6 疫苗研究進(jìn)展
    1.2 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 蟲株與載體
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.3 主要試劑與試劑盒
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 主要溶液的配制
        2.1.6 數(shù)據(jù)分析
    2.2 隱孢子蟲分離與鑒定
        2.2.1 隱孢子蟲卵囊的分離與鏡檢
        2.2.2 隱孢子蟲PCR鑒定
        2.2.3 pEASY-18SrRNA質(zhì)粒構(gòu)建及序列測(cè)序
    2.3 18 SrRNA熒光定量PCR方法的建立
        2.3.1 熒光定量PCR引物驗(yàn)證
        2.3.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化
        2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        2.3.4 特異性分析
        2.3.5 重復(fù)性分析
        2.3.6 熒光定量PCR方法臨床應(yīng)用
    2.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白表達(dá)
        2.4.1 pEASY-CP23克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
        2.4.2 pET28-CP23表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定
        2.4.3 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
    2.5 CP23蛋白免疫原性分析
        2.5.1 動(dòng)物分組及血清制備
        2.5.2 體液免疫水平檢測(cè)
        2.5.3 細(xì)胞免疫水平檢測(cè)
3.結(jié)果
    3.1 隱孢子蟲分離鑒定結(jié)果
        3.1.1 卵囊分離與鏡檢結(jié)果
        3.1.2 18 SrRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.1.3 pEASY-18SrRNA測(cè)序結(jié)果
    3.2 熒光定量PCR方法的建立
        3.2.1 熒光定量PCR引物驗(yàn)證
        3.2.2 熒光定量PCR條件的優(yōu)化
        3.2.3 擴(kuò)增曲線的繪制
        3.2.4 特異性分析
        3.2.5 重復(fù)性分析結(jié)果
        3.2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果
    3.3 pET28a-CP23載體構(gòu)建與蛋白表達(dá)結(jié)果
        3.3.1 pEASY-CP23質(zhì)粒的鑒定結(jié)果
        3.3.2 pET28-CP23質(zhì)粒鑒定結(jié)果
        3.3.3 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定結(jié)果
    3.4 CP23蛋白免疫原性分析
        3.4.1 IgG抗體水平變化分析
        3.4.2 CD4⁺、CD8⁺T淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化
        3.4.3 脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果
        3.4.4 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果
4.討論
5.結(jié)論
參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)介
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
中文詳細(xì)摘要



本文編號(hào)：3961023