隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)是隱孢子蟲(Cryptosporidium)寄生于人類和動物呼吸道或消化道上皮細胞刷狀緣納蟲空泡中,以腹瀉、脫水為主要臨床癥狀的寄生性原蟲病。隱孢子蟲可感染多種動物,其中幼齡動物最易感,是新生動物腹瀉的病因之一。隱孢子蟲病已嚴重危害人類和動物健康,給畜牧業(yè)帶來嚴重的經濟損失,目前無有效的治療藥物,疫苗免疫是防控該病的新策略,因此,篩選免疫原性高的靶抗原具有相當重要的意義。目前保定地區(qū)對微小隱孢子蟲相關研究較少,對重組蛋白CP23免疫特性進行研究,為抗微小隱孢子蟲疫苗和免疫學診斷方法的研制提供了候選抗原,為隱孢子蟲病的防控奠定了基礎。本試驗從河北保定地區(qū)分離得到奶牛源隱孢子蟲卵囊,通過PCR擴增獲得18SrRNA全基因1188bp的片段,構建pEASY-18SrRNA質粒并測序,對測序序列應用DNAStar軟件進行分析,結果表明分離到的蟲種為微小隱孢子蟲。將Cp23基因克隆至原核表達載體pET-28a(+)中,構建原核表達載體pET28a-Cp23。并用IPTG誘導表達,通過SDS-PAGE結果顯示,表達蛋白分子量為25kDa,且為包涵體蛋...

【文章頁數】：75 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 隱孢子蟲概述
        1.1.1 病原學研究
        1.1.2 生活史
        1.1.3 流行特點
        1.1.4 表面粘附蛋白
        1.1.5 實驗室診斷技術
        1.1.6 疫苗研究進展
    1.2 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 蟲株與載體
        2.1.2 實驗動物
        2.1.3 主要試劑與試劑盒
        2.1.4 主要儀器
        2.1.5 主要溶液的配制
        2.1.6 數據分析
    2.2 隱孢子蟲分離與鑒定
        2.2.1 隱孢子蟲卵囊的分離與鏡檢
        2.2.2 隱孢子蟲PCR鑒定
        2.2.3 pEASY-18SrRNA質粒構建及序列測序
    2.3 18 SrRNA熒光定量PCR方法的建立
        2.3.1 熒光定量PCR引物驗證
        2.3.2 反應條件的優(yōu)化
        2.3.3 標準曲線的建立
        2.3.4 特異性分析
        2.3.5 重復性分析
        2.3.6 熒光定量PCR方法臨床應用
    2.4 原核表達載體的構建與蛋白表達
        2.4.1 pEASY-CP23克隆質粒的構建及鑒定
        2.4.2 pET28-CP23表達質粒構建及鑒定
        2.4.3 重組菌誘導表達及鑒定
    2.5 CP23蛋白免疫原性分析
        2.5.1 動物分組及血清制備
        2.5.2 體液免疫水平檢測
        2.5.3 細胞免疫水平檢測
3.結果
    3.1 隱孢子蟲分離鑒定結果
        3.1.1 卵囊分離與鏡檢結果
        3.1.2 18 SrRNA基因PCR擴增結果
        3.1.3 pEASY-18SrRNA測序結果
    3.2 熒光定量PCR方法的建立
        3.2.1 熒光定量PCR引物驗證
        3.2.2 熒光定量PCR條件的優(yōu)化
        3.2.3 擴增曲線的繪制
        3.2.4 特異性分析
        3.2.5 重復性分析結果
        3.2.6 臨床樣品檢測結果
    3.3 pET28a-CP23載體構建與蛋白表達結果
        3.3.1 pEASY-CP23質粒的鑒定結果
        3.3.2 pET28-CP23質粒鑒定結果
        3.3.3 重組菌誘導表達及鑒定結果
    3.4 CP23蛋白免疫原性分析
        3.4.1 IgG抗體水平變化分析
        3.4.2 CD4⁺、CD8⁺T淋巴細胞數量的變化
        3.4.3 脾淋巴細胞增殖試驗結果
        3.4.4 細胞因子檢測結果
4.討論
5.結論
參考文獻
作者簡介
在讀期間發(fā)表的學術論文
致謝
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本文編號：3961023