鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)是威脅和危害水禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要病原之一,但其致病機理尚未得到完全闡明。NF-κB分子是動物機體NF-κB信號通路關(guān)鍵分子,在動物多種生物學過程中發(fā)揮重要作用,與炎癥過程和病毒侵染有關(guān),且NF-κB信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子有IL-1β等細胞因子,但有關(guān)DEV感染與NF-κB信號通路的關(guān)聯(lián)性,未見研究報道。為此,本研究采用RNAi技術(shù)沉默NF-κB1基因,分析NF-κB1基因?qū)EV增殖影響,以及分析NF-κB信號通路的下游關(guān)鍵調(diào)控因子IL-1β的變化,以期為DEV致病機理的揭示提供一些基礎(chǔ)依據(jù)。1.鴨源IL-1β基因RT-PCR檢測方法的建立根據(jù)GenBank上鴨源IL-1β基因設(shè)計特異性引物,進行PCR擴增得到IL-1β基因片段,回收純化后連接至pMD19-T載體,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并增菌,提取重組質(zhì)粒進行鑒定,以重組質(zhì)粒為模板進行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測并進行特異性、重復性和敏感性檢驗,結(jié)果顯示:建立的鴨源IL-1β基因熒光定量PCR方法擴增曲線良好,標準曲線方程y=-3.329x+39.731,擴增效率...

【文章頁數(shù)】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
略縮詞
文獻綜述
    1 DEV概況
        1.1 DEV形態(tài)結(jié)構(gòu)特征
        1.2 DEV增殖過程
        1.3 DEV致病特征及防控
    2 NF-κB信號通路概況
        2.1 NF-κB家族成員
        2.2 NF-κB信號通路的激活
        2.3 NF-κB信號通路與病原體感染
    3 RNAi技術(shù)概況
        3.1 RNAi技術(shù)簡介
        3.2 RNAi作用機制
        3.3 RNAi技術(shù)應用
實驗研究
    前言
    1 材料
        1.1 實驗動物
        1.2 毒株和質(zhì)粒
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器
    2 方法
        2.1 IL-1β實時熒光定量PCR方法的建立
            2.1.1 IL-1β引物合成
            2.1.2 IL-1β PCR擴增
            2.1.3 標準質(zhì)粒構(gòu)建
            2.1.4 熒光定量PCR方法建立
        2.2 DEV感染后鴨各組織IL-1β的變化
            2.2.1 人工感染及樣品采集
            2.2.2 DEV-NP基因PCR檢測
            2.2.3 IL-1β基因的轉(zhuǎn)錄水平變化
        2.3 NF-κB1 sh RNA質(zhì)粒的篩選
            2.3.1 鴨胚成纖維細胞的制備與培養(yǎng)
            2.3.2 干擾重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DEF細胞
            2.3.3 NF-κB1基因轉(zhuǎn)錄情況檢測
            2.3.4 干擾重組質(zhì)粒對DEF細胞自身的影響
        2.4 NF-κB1 RNAi對DEF細胞中DEV增殖的影響
            2.4.1 DEV和干擾重組質(zhì)粒處理DEF細胞
            2.4.2 DEV-NP基因的檢測
            2.4.3 NF-κB關(guān)鍵因子IL-1β的檢測
            2.4.4 NF-κB通路下游因子的檢測
    3 結(jié)果
        3.1 IL-1β實時熒光定量PCR方法的建立
            3.1.1 IL-1β基因標準質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.1.2 熒光定量PCR方法建立結(jié)果
            3.1.3 重復性、敏感性、特異性檢驗
        3.2 DEV感染后鴨各組織IL-1β轉(zhuǎn)錄變化
            3.2.1 DEV-NP基因PCR檢測結(jié)果
            3.2.2 IL-1β基因轉(zhuǎn)錄水平變化
        3.3 干擾重組質(zhì)粒篩選
            3.3.1 干擾重組質(zhì)粒干擾效率比較
            3.3.2 干擾重組質(zhì)粒對DEF細胞的影響
        3.4 NF-κB1 RNAi對DEV在DEF細胞中增殖的影響
            3.4.1 干擾重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染熒光觀察
            3.4.2 DEV-NP基因的檢測
            3.4.3 NF-κB關(guān)鍵因子IL-1β的檢測
            3.4.4 NF-κB通路下游因子的檢測
    4 分析與討論
        4.1 關(guān)于DEV感染后鴨組織中IL-1β的檢測
        4.2 NF-κB與IL-1β的關(guān)系
        4.3 NF-κB與DEV的關(guān)系
        4.4 NF-κB與機體正常細胞生長的關(guān)系
    5 展望
全文結(jié)論
參考文獻
致謝
附錄



本文編號：3960927