微小隱孢子蟲(C. parvum)為細(xì)胞內(nèi)原蟲，主要感染宿主小腸上皮細(xì)胞，可引起人獸共患隱孢子蟲�。╟ryptosporidiosis），該病通常由于宿主接觸糞便中的卵囊而傳播。在免疫功能正常的宿主體內(nèi)此病表現(xiàn)為腹痛、發(fā)熱、嘔吐和腹瀉等臨床癥狀，一般7-14天可自愈。但是在免疫功能低下的宿主體內(nèi)，尤其是在艾滋病患者和營(yíng)養(yǎng)不良的兒童中，此病可能引起持續(xù)性腹瀉，甚至?xí)䦟?dǎo)致死亡。由于治療隱孢子蟲病的方法有限，因此對(duì)該疾病的早期診斷尤為重要。目前，用于隱孢子蟲感染的診斷方法主要是糞檢，但該方法存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力和敏感性低等缺點(diǎn)。免疫學(xué)方法具有省時(shí)、省力及易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，適用于大規(guī)模的流行病學(xué)篩查，但該方法的關(guān)鍵在于獲得高特異性和敏感性的抗原。 本研究首先采用SMART技術(shù)構(gòu)建微小隱孢子蟲cDNA文庫(kù)。純化微小隱孢子蟲卵囊，Trizol試劑提取總RNA，蛋白酶K消化與Sfi酶切合成的雙連cDNA，連接λTriplEx2載體，然后對(duì)原始文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增。測(cè)定原始與擴(kuò)增后的文庫(kù)滴度分別為4.5×107pfu/mL和8.34×109pfu/mL，文庫(kù)cDNA插入片段長(zhǎng)度為1.5kb左右。用大腸埃希菌裂解液孵...

【文章頁(yè)數(shù)】：84 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.1微小隱孢子蟲總RNA的電泳圖譜

OD260/OD280值為1.92。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果中可以清楚地看到18S和28SrRNA兩條較亮的電泳帶(圖1.1)，提取的總RNA完整并且穩(wěn)定，可以用于構(gòu)建cDNA文庫(kù)。圖1.1微小隱孢子蟲總RNA的電泳圖譜Figure1.1Cryp....

圖1.2微小隱孢子蟲cDNA的電泳圖譜

小隱孢子蟲cDNA的oridiumparvumcDNA0Marker;1:Double-str庫(kù)質(zhì)量鑒定4，105時(shí)，統(tǒng)計(jì)噬菌斑始庫(kù)容量為4.5×107pf長(zhǎng)度。從電泳圖譜可以1.5kb左右，符合生物06，107，統(tǒng)計(jì)每個(gè)平板數(shù)量為0個(gè)，計(jì)算得擴(kuò)

圖1.3噬菌斑插入片段長(zhǎng)度的PCR檢測(cè)結(jié)果

圖1.2微小隱孢子蟲cDNA的電泳圖譜Figure1.2CryptosporidiumparvumcDNAelectrophoresispatternM:DL2000Marker;1:Double-strandedcDNA小隱孢子蟲cDNA文庫(kù)....

圖2.1兔抗微小隱孢子蟲血清效價(jià)的ELISA檢測(cè)Figure2.1Detectionofrabbitanti-C.parvumserumtiterbyELISA

陰性血清與每次免疫前的抗血清稀釋倍數(shù)分別為500倍、1000倍、2000倍、4000倍、8000倍、16000倍。結(jié)果顯示第四次免疫后所得的抗血清效價(jià)達(dá)到1：16000以上（圖2.1），可以作為高免血清抗體用于文庫(kù)篩選。圖2.1兔抗微小隱孢子蟲血清效價(jià)的ELISA檢測(cè)Fi....

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