豬偽狂犬病給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,當(dāng)前的疫苗不能完全防止由變異毒株帶來的危害。揭示病毒感染、傳播、潛伏、再激活等機(jī)制,有利于研發(fā)新的疫苗,開發(fā)新的抗病毒藥物。目前的很多研究主要是基于蛋白展開的,在核酸水平揭示機(jī)制,有望給偽狂犬病毒研究提供新的思路。G-四鏈體是由鳥嘌呤富集序列形成的特殊核酸二級結(jié)構(gòu),許多病毒基因組中的G-四鏈體可以調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄以及翻譯過程。豬偽狂犬病毒中的G-四鏈體可形成序列也有可能影響偽狂犬病毒的復(fù)制。IE180基因作為偽狂犬病毒基因組中唯一的立即早期基因,激活其它基因轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。本研究發(fā)現(xiàn)IE180基因3’UTR區(qū)域存在大量G-四鏈體可形成序列,研究這些序列對轉(zhuǎn)錄、翻譯的影響,有望揭示G-四鏈體在偽狂犬病毒中的功能,開發(fā)靶向G-四鏈體的抗病毒抑制劑。本論文具體工作如下:1.IE180基因3’UTR的G-四鏈體可形成序列的結(jié)構(gòu)與功能分析1)在IE180基因3’UTR搜索到兩段有望形成G-四鏈體的富G序列(157-170區(qū)間與256-366區(qū)間);2)發(fā)現(xiàn)157-170序列符合G-四鏈體可形成序列特征,但形成雙螺旋結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)的形成抑制報告基因的翻譯;3...

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略表語
第一章 緒論
    1 偽狂犬病毒
        1.1 偽狂犬病
        1.2 偽狂犬病毒
        1.3 IE180基因
    2 G-四鏈體
        2.1 G-四鏈體結(jié)構(gòu)
        2.2 G-四鏈體的生物學(xué)意義
    3 G-四鏈體及配體在病毒中的研究
        3.1 HIV基因組中G-四鏈體和TmPyP4
        3.2 EBV中EBNA1基因mRNAG-四鏈體和PDS
        3.3 HSV-1基因組中G-四鏈體和BRACO-19
    4 G-四鏈體在3’端非翻譯區(qū)中的功能
        4.1 調(diào)控mRNA穩(wěn)定性
        4.2 調(diào)控mRNA的亞細(xì)胞定位
        4.3 調(diào)控翻譯過程
    5 論文設(shè)計思想
第二章 IE180基因3’UTR的G-四鏈體可形成序列的結(jié)構(gòu)與功能分析
    1 前言
    2 試劑與儀器
        2.1 化學(xué)藥品與生物試劑
        2.2 儀器
    3 材料與方法
        3.1 3 ’RACE法克隆PRVEa毒株IE180基因3’UTR
            3.1.1 從感染病毒的細(xì)胞樣品中提取總RNA
            3.1.2 3 ’末端快速擴(kuò)增技術(shù)
            3.1.3 目的片段克隆
        3.2 不同偽狂犬病毒毒株IE180基因3’UTR序列收集與保守性分析
        3.3 G-四鏈體可形成序列預(yù)測軟件分析IE180基因3’UTR富G序列
        3.4 圓二色光譜分析核酸形成的結(jié)構(gòu)
        3.5 構(gòu)建含有野生型與突變型3’UTR雙熒光素酶報告載體
            3.5.1 克隆野生型3’UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒
            3.5.2 同源重組法構(gòu)建突變型3’UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒
        3.6 實時熒光定量PCR檢測G-四鏈體形成對轉(zhuǎn)錄的影響
            3.6.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
            3.6.2 提取細(xì)胞總RNA
            3.6.3 模板cDNA制備
            3.6.4 實時熒光定量PCR
        3.7 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測G-四鏈體形成對翻譯的影響
            3.7.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
            3.7.2 雙熒光素酶檢測
        3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析
    4 結(jié)果與分析
        4.1 PRVEa毒株IE180基因3’UTR序列克隆
        4.2 IE180基因3’UTRG-四鏈體可形成序列鑒定及結(jié)構(gòu)分析
            4.2.1 IE180基因3’UTR富G序列分析
            4.2.2 富G序列157-170分析
                4.2.2.1 富G序列157-170保守性分析
                4.2.2.2 富G序列157-170結(jié)構(gòu)分析
            4.2.3 富G序列256-366分析
                4.2.3.1 富G序列256-366保守性分析
                4.2.3.2 富G序列256-366結(jié)構(gòu)分析
                4.2.3.3 G-四鏈體可形成序列PQS3與PQS18保守性分析
                4.2.3.4 G-四鏈體可形成序列PQS3與PQS18結(jié)構(gòu)分析
        4.3 IE180基因3’UTR的G-四鏈體可形成序列對轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響
            4.3.1 野生型與突變型3’UTR雙熒光素酶報告載體構(gòu)建
            4.3.2 富G序列157-170對轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響
                4.3.2.1 富G序列157-170對轉(zhuǎn)錄的影響
                4.3.2.2 富G序列157-170對翻譯的影響
            4.3.3 富G序列256-366對轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響
                4.3.3.1 富G序列256-366對轉(zhuǎn)錄的影響
                4.3.3.2 富G序列256-366對翻譯的影響
                4.3.3.3 G-四鏈體可形成序列PQS3對轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響
                4.3.3.4 G-四鏈體可形成序列PQS18對轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響
    5 結(jié)論
第三章 G-四鏈體配體小分子TmPyP4抗偽狂犬病毒研究
    1 前言
    2 試劑與儀器
        2.1 化學(xué)藥品與生物試劑
        2.2 儀器
    3 材料與方法
        3.1 紫外-可見吸收光譜分析TmPyP4與PQS18相互作用
        3.2 G-四鏈體配體小分子TmPyP4對293T細(xì)胞毒性分析實驗
        3.3 雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測TmPyP4對轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響
        3.4 G-四鏈體配體小分子TmPyP4對PK15細(xì)胞毒性分析實驗
        3.5 TmPyP4抗病毒實驗
            3.5.1 TmPyP4與病毒的直接相互作用
            3.5.2 TmPyP4作用于病毒增殖過程
    4 結(jié)果與分析
        4.1 TmPyP4穩(wěn)定PQS18G-四鏈體結(jié)構(gòu)
        4.2 TmPyP4對報告基因轉(zhuǎn)錄與翻譯的影響
            4.2.1 TmPyP4對293T細(xì)胞最大適用濃度
            4.2.2 TmPyP4對報告基因轉(zhuǎn)錄和翻譯影響
        4.3 TmPyP4抗偽狂犬病毒分析
            4.3.1 TmPyP4對PK15細(xì)胞最大適用濃度的檢測
            4.3.2 TmPyP4對PRV的滅活作用
            4.3.3 TmPyP4對PRV增殖過程的影響
    5 結(jié)論
第四章 總結(jié)與展望
    1 結(jié)論
    2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    S1 引物表
    S2 載體
    S3 不同偽狂犬病毒毒株IE180基因3’UTR序列比對結(jié)果
    S4 突變型3’UTR雙熒光素酶報告載體
致謝



本文編號：3953364