試驗(yàn)旨在表達(dá)、純化擴(kuò)展莫尼茨絳蟲VASA蛋白,并制備兔抗VASA多克隆抗體。根據(jù)擴(kuò)展莫尼茨絳蟲全基因核苷酸序列設(shè)計特異性引物,利用PCR方法擴(kuò)增vasa基因片段;將擴(kuò)增產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET-22b(+)連接,獲得重組質(zhì)粒pET-22b-VASA;經(jīng)Amp抗性篩選陽性菌,雙酶切、PCR測序鑒定后,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,并進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá);重組融合蛋白經(jīng)鎳柱純化后,進(jìn)行Western blot鑒定;將融合蛋白免疫兔,制備多克隆抗體。結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒pET-22b-VASA構(gòu)建正確,通過IPTG誘導(dǎo)獲得大小約32 200的VASA重組融合蛋白;Western blot分析表明其與鼠抗His單克隆抗體呈陽性反應(yīng)。純化的VASA蛋白免疫兔獲得了多克隆抗體,ELISA檢測其效價為1∶128 000。本試驗(yàn)成功制備了具有免疫原性的VASA蛋白及其兔源多克隆抗體,為VASA蛋白生物學(xué)功能及該蛋白在絳蟲體內(nèi)的分布等研究奠定基礎(chǔ)。

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【部分圖文】：

圖1vasa基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

重組質(zhì)粒,用XhoI、MluⅠ進(jìn)行雙酶切獲得1628,4537bp2個片段,結(jié)果表明獲得了含vasa基因的重組質(zhì)粒(圖2),其中PET-22b為空質(zhì)粒對照(圖3)。圖2PET-22b-vasa重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖2PET-22b-vasa重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖1vasa基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果圖3PET-22b空質(zhì)粒電泳圖

圖3PET-22b空質(zhì)粒電泳圖

圖2PET-22b-vasa重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定2.3重組蛋白的表達(dá)鑒定

圖4pET-22b-vasaSDS-PAGE電泳結(jié)果

SDS-PAGE分析結(jié)果表明,pET-22b-vasa誘導(dǎo)前沒有相應(yīng)的特異條帶;37℃,0.5mmol/LIPTG條件下誘導(dǎo)4h后在約32200處出現(xiàn)與預(yù)計大小一致的條帶;表明目的基因在大腸桿菌中獲得正確表達(dá)(圖4),且在37℃,IPTG終濃度為0.2mmol/L的沉....

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