旨在研究RB1基因在雞前脂肪細(xì)胞分化和增殖過程中的功能,本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞前脂肪細(xì)胞中敲除RB1基因,檢測(cè)雞前脂肪細(xì)胞的分化和增殖能力及相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明,CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠有效介導(dǎo)RB1基因的敲除并引起RB1基因翻譯的提前終止,敲除效率可以達(dá)到10%。油紅O提取比色和CCK-8的結(jié)果顯示,敲除RB1基因后,雞前脂肪細(xì)胞的分化能力減弱、增殖能力增強(qiáng);qRT-PCR結(jié)果顯示,RB1基因敲除之后脂肪細(xì)胞分化標(biāo)志基因G0S2、FAS、A-FABP的mRNA表達(dá)水平下降,尤其是G0S2基因的表達(dá)水平在前脂肪細(xì)胞分化的各個(gè)階段都表現(xiàn)為顯著的下降。同時(shí)RB1基因敲除還引起細(xì)胞周期相關(guān)基因CyclinD1、E2F1、Ki67、PCNA的mRNA表達(dá)水平升高。初步推斷,RB1基因可能是調(diào)控雞前脂肪細(xì)胞分化和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

【文章頁數(shù)】：10 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 gRNA的設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建
        1.2.2 gRNA的體外轉(zhuǎn)錄及體外切割活性檢測(cè)
        1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        1.2.4 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的細(xì)胞打靶效率和突變模式檢測(cè)
        1.2.5 前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化和油紅O染色及提取比色
        1.2.6 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖
        1.2.7 基因表達(dá)檢測(cè)
2 結(jié)果
    2.1 雞RB1基因打靶載體的構(gòu)建以及gRNA打靶效率的體外酶切檢測(cè)
    2.2 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的雞前脂肪細(xì)胞中RB1基因的敲除
    2.3 RB1基因促進(jìn)雞前脂肪細(xì)胞的分化
    2.4 RB1基因抑制雞前脂肪細(xì)胞的增殖
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