新疆不僅是畜牧業(yè)大省,同時也是棉花種植大省。產(chǎn)量豐富的棉籽餅粕,蛋白質(zhì)含量高,價格低廉,大量應(yīng)用棉籽餅粕作為飼料來源,是解決新疆南疆綿羊飼料短缺的有效方法之一。然而,棉籽餅粕中含有棉酚,棉酚是一種細(xì)胞毒、血管毒、神經(jīng)毒,可對綿羊機(jī)體造成損傷,從而制約了棉籽餅粕在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。IL-8是一種能激活嗜中性粒細(xì)胞的趨化性細(xì)胞因子,對炎癥和免疫反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。為了了解棉酚對多浪羊損傷的過程中,IL-8對機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用,本實驗采取實時熒光定量PCR法測定不同濃度、不同時間的棉酚作用于多浪羊淋巴細(xì)胞后IL-8基因的表達(dá)量變化,以便用于更好地指導(dǎo)生產(chǎn)實踐。以新疆多浪羊為研究對象,分離多浪羊的外周血淋巴細(xì)胞,以不同濃度(5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L、35μmol/L)的棉酚進(jìn)行刺激,刺激時間1h、2h、3h、4h、8h,提取總RNA,采用實時熒光定量PCR檢測IL-8基因的表達(dá)。結(jié)果表明,隨著棉酚濃度的增加和作用時間的延長,IL-8的表達(dá)量先呈現(xiàn)出遞增后迅速下降,棉酚作用濃度10μmol/L,作用時間2h時IL-...

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
前言
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 棉酚的研究進(jìn)展
        1.1.1 棉酚的結(jié)構(gòu)性質(zhì)
        1.1.2 棉酚的生物學(xué)作用
        1.1.3 棉酚的毒理學(xué)作用
    1.2 IL-8的研究進(jìn)展
        1.2.1 IL-8的產(chǎn)生
        1.2.2 IL-8的基因定位及結(jié)構(gòu)
        1.2.3 IL-8的受體結(jié)構(gòu)
        1.2.4 IL-8的生物學(xué)功能
    1.3 基因差異表達(dá)方法
第2章 棉酚對多浪羊淋巴細(xì)胞IL-8基因表達(dá)的影響
    2.1 材料
        2.1.1 試驗材料
        2.1.2 試驗試劑
        2.1.3 試驗儀器
    2.2 方法
        2.2.1 多浪羊淋巴細(xì)胞的分離
        2.2.2 不同濃度棉酚作用于多浪羊淋巴細(xì)胞
        2.2.3 總RNA的提取
        2.2.4 cDNA的合成
        2.2.5 引物設(shè)計
        2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成
        2.2.7 采用2⁽－△△^CT)法分析棉酚對IL-8基因的表達(dá)量
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 IL-8基因標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果
        2.3.2 GAPDH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果
        2.3.3 2
(－△△(^CT))法分析棉酚對IL-8基因的表達(dá)量結(jié)果
        2.3.4 不同時間棉酚作用對IL-8基因表達(dá)量的影響
        2.3.5 不同濃度棉酚作用對IL-8基因表達(dá)量的影響
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第3章 新疆多浪羊pcDNA3.1-GFP-IL-8真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
    3.1 材料
        3.1.1 載體、宿主菌及樣本
        3.1.2 試驗試劑
        3.1.3 試驗儀器
        3.1.4 引物設(shè)計
    3.2 方法
        3.2.1 多浪羊淋巴細(xì)胞的分離
        3.2.2 總RNA提取、cDNA合成
        3.2.3 IL-8的PCR擴(kuò)增與純化
        3.2.4 pMD-18T-IL-8重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        3.2.5 重組質(zhì)粒pMD-18T-IL-8的鑒定
        3.2.6 pcDNA3.1-GFP與IL-8的連接
        3.2.7 pcDNA3.1-GFP-IL-8轉(zhuǎn)化DH5α
        3.2.8 PCR法鑒定pcDNA3.1-GFP-IL-8中IL-8片段
        3.2.9 酶切質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP-IL-8鑒定IL-8基因
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 總RNA電泳鑒定結(jié)果
        3.3.2 IL-8的PCR電泳鑒定結(jié)果
        3.3.3 重組質(zhì)粒pMD-18T-IL-8的菌落PCR鑒定結(jié)果
        3.3.4 重組質(zhì)粒pMD-18T-IL-8的酶切鑒定結(jié)果
        3.3.5 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP-IL-8PCR鑒定結(jié)果
        3.3.6 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP-IL-8酶切鑒定結(jié)果
        3.3.7 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP-IL-8酶切產(chǎn)物DNA序列測定結(jié)果
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第4章 棉酚對多浪羊淋巴細(xì)胞IL-8的表達(dá)影響研究
    4.1 材料
        4.1.1 試驗試劑
        4.1.2 試驗儀器
        4.1.3 試驗溶液的配制
    4.2 方法
        4.2.1 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GFP、pcDNA3.1-GFP-IL-8至淋巴細(xì)胞
        4.2.2 實時熒光定量PCR檢測六種處理IL-8的基因表達(dá)
        4.2.3 Westernblotting檢測六種處理IL-8的蛋白表達(dá)
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-GFP、pcDNA3.1-GFP-IL-8至淋巴細(xì)胞的鏡檢圖與分析
        4.3.2 實時熒光定量PCR檢測六種處理IL-8的基因表達(dá)結(jié)果分析
        4.3.3 Westernblotting檢測六種處理IL-8的蛋白電泳結(jié)果
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介



本文編號：3951241