禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(ReticuLoendotheliosis, RE)是由禽網(wǎng)內(nèi)狀皮組織增生病病毒(ReticuLoendotheliosis Virus, REV)引起禽類發(fā)生的以淋巴網(wǎng)狀細胞增生為特征的腫瘤性病理綜合征。REV在我國家禽中的感染率已達30%左右,REV感染不僅能引起腫瘤,還可以引起胸腺、法氏囊等免疫器官萎縮,導(dǎo)致免疫功能下降、甚至免疫抑制,并且極易繼發(fā)感染其他病毒病和細菌病。REV一旦污染生物制品后,可以導(dǎo)致REV大面積人工傳播,給養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。因為REV感染雞群無明顯癥狀和病變,因此REV的檢測顯得尤為重要。 本文首先以禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥病毒的cDNA建立了PCR檢測方法。是以全病毒感染為基礎(chǔ)所建立的檢測方法。在REV的3個基因上設(shè)計了3種特異引物,能特異性的檢測REV樣品,最低檢測限度為104拷貝/uL。PCR檢測方法不與其他禽病病原發(fā)生交叉反應(yīng),重復(fù)性和穩(wěn)定性好。 其次以REV的LTR和gag基因的保守區(qū)域各設(shè)計并合成一對引物,建立SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR檢測方法(Real-time PCR)。以pMD-18T-LTR (p-L...

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1.引言
    1.1 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖癥及禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增殖癥病毒
        1.1.1 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病概述
        1.1.2 REV生物學(xué)特征
        1.1.3 傳播途徑
        1.1.4 發(fā)病機理
        1.1.5 臨床癥狀
        1.1.6 危害
        1.1.7 防治措施
    1.2 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖病的實驗室診斷技術(shù)研究進展
        1.2.1 病毒的分離鑒定
        1.2.2 抗體的檢測
        1.2.3 抗原的檢測
        1.2.4 分子診斷技術(shù)
        1.2.5 鑒別診斷
    1.3 實驗室診斷技術(shù)的意義
2.REV聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)檢測方法的建立
    2.1 材料
        2.1.1 聚合酶及其他試劑
        2.1.2 實驗材料
        2.1.3 儀器
    2.2 方法
        2.2.1 PCR的引物設(shè)計
        2.2.2 REV增殖，RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
        2.2.3 PCR擴增
        2.2.4 PCR產(chǎn)物的純化
        2.2.5 PCR擴增產(chǎn)物的測序鑒定
        2.2.6 最佳反應(yīng)模式的確定
        2.2.7 PCR檢測方法敏感性的檢測
        2.2.8 PCR檢測方法特異性的檢測
        2.2.9 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 REV PCR擴增結(jié)果
        2.3.2 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
        2.3.3 PCR檢測方法敏感性的檢測
        2.3.4 PCR檢測方法特異性的檢測
        2.3.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗結(jié)果
    2.4 討論
3.REV SYBR Green Ⅰ實時熒光檢測方法的建立
    3.1 材料
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 主要試劑及儀器
    3.2 方法
        3.2.1 引物的設(shè)計與合成
        3.2.2 REV增殖, RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
        3.2.3 標準品的制備
        3.2.4 熒光定量最佳反應(yīng)模式的確定
        3.2.5 標準曲線、熔解曲線的繪制
        3.2.6 特異性試驗
        3.2.7 敏感性試驗
        3.2.8 重復(fù)性試驗
        3.2.9 樣品檢測
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 標準曲線的建立
        3.3.2 特異性試驗
        3.3.3 敏感性試驗將
        3.3.4 重復(fù)性試驗
        3.3.5 樣品檢測
    3.4 討論
4.REV間接ELISA檢測方法的建立
    4.1 材料
        4.1.1 實驗試劑
        4.1.2 實驗材料
        4.1.3 主要儀器
    4.2 方法
        4.2.1 禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織増殖病病毒pET32a-gp90原核表達載體構(gòu)建
        4.2.2 pET32a-gp90蛋白的原核表達和鑒定
        4.2.3 pET32a-gp90基因片段表達產(chǎn)物的Westenr Blot分析
        4.2.4 pET32a-gp90基因片段原核表達蛋白的純化
        4.2.5 pET32a-gp90間接ELISA檢測方法的建立
        4.2.6 特異性試驗
        4.2.7 間接ELISA重復(fù)性試驗
        4.2.8 抗體間接ELISA與同類商品化試劑盒的對比
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 pET32a-gp90基因片段重組表達載體的鑒定
        4.3.2 pET32a-gp90基因片段在大腸桿菌中的表達
        4.3.3 表達蛋白的Western-blotting分析
        4.3.4 pET32a-gp90基因片段原核表達蛋白的可溶性分析
        4.3.5 pET32a-gp90基因片段表達產(chǎn)物的純化分析
        4.3.6 pET32a-gp90蛋白間接ELISA方法的建立
        4.3.7 pET32a-gp90蛋白間接ELISA特異性檢測
        4.3.8 pET32a-gp90蛋白間接ELISA重復(fù)性試驗
        4.3.9 pET32a-gp90蛋白間接ELISA與同類商品化試劑盒的對比
    4.4 討論
5.三種檢測方法的比較
6.結(jié)論
致謝
參考文獻
附錄
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3949333