雞新城疫(Newcastle disease,ND)作為OIE A類疾病,雞傳染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)作為B類傳染病,給全球養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在我國(guó),雞新城疫與傳染性法氏囊病一直是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的重要傳染病。雞新城疫傳染性強(qiáng)、死亡率高,且感染宿主范圍越來(lái)越廣。雞傳染性法氏囊病主要破壞雞的體液免疫中樞器官—法氏囊,導(dǎo)致淋巴細(xì)胞功能受損,引起雞體的免疫抑制,從而影響新城疫、禽流感等疫苗的免疫效果。當(dāng)前由于NDV及IBDV變異株、超強(qiáng)毒株和新毒株的流行,導(dǎo)致傳統(tǒng)疫苗免疫效果有所降低,因此,研發(fā)防控ND和IBD的新型疫苗顯得尤為重要。減毒沙門(mén)菌作為疫苗活載體是一種天然的黏膜免疫增強(qiáng)劑,可以實(shí)現(xiàn)多種抗原的遞呈,經(jīng)口服免疫可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的的黏膜、體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此,本研究采用asd+宿主-載體平衡致死系統(tǒng),將NDV HN和IBDV VP2基因串聯(lián)克隆至無(wú)抗性表達(dá)載體pYA3493中,并電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門(mén)菌,成功構(gòu)建了表達(dá)HN和VP2融合蛋白的重組減毒沙門(mén)菌候選疫苗,對(duì)其生物學(xué)及免疫學(xué)特性進(jìn)行研究,為新城疫-傳染性法氏囊-...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號(hào)表
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 雞新城疫研究進(jìn)展
        1.1.1 ND病原學(xué)研究
        1.1.2 NDV分子生物學(xué)研究
        1.1.3 ND流行病學(xué)研究
        1.1.4 ND的診斷與防制
    1.2 雞傳染性法氏囊研究進(jìn)展
        1.2.1 IBD病原學(xué)研究
        1.2.2 IBD流行病學(xué)研究
        1.2.3 IBD的診斷
        1.2.4 IBD的防治
    1.3 減毒沙門(mén)菌作為疫苗活載體的研究進(jìn)展
        1.3.1 沙門(mén)菌減毒的相關(guān)基因
        1.3.2 減毒沙門(mén)菌誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答
        1.3.3 減毒沙門(mén)菌載體的優(yōu)缺點(diǎn)
        1.3.4 減毒沙門(mén)菌載體的應(yīng)用
    1.4 展望
第2章 NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的原核表達(dá)及鑒定
    2.1 材料
        2.1.1 菌株及質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要培養(yǎng)基、試劑的配制
        2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)器材
    2.2 方法
        2.2.1 目的基因的擴(kuò)增
        2.2.2 目的基因的回收
        2.2.3 融合基因片段的獲取
        2.2.4 DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.5 重組質(zhì)粒pMD19-T-HN-VP2的構(gòu)建
        2.2.6 重組質(zhì)粒的提取
        2.2.7 重組質(zhì)粒pMD19-T-HN-VP2的鑒定
        2.2.8 重組質(zhì)粒pET32a-HN-VP2的構(gòu)建及鑒定
        2.2.9 融合蛋白的表達(dá)及鑒定
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 HN基因片段及VP2主要抗原片段的擴(kuò)增
        2.3.2 融合基因HN-VP2擴(kuò)增結(jié)果
        2.3.3 重組質(zhì)粒pMD19-T-HN-VP2的PCR鑒定
        2.3.4 重組質(zhì)粒pMD19-T-HN-VP2的雙酶切鑒定
        2.3.5 重組質(zhì)粒pET32a-HN-VP2的PCR鑒定
        2.3.6 重組質(zhì)粒pET32a-HN-VP2的雙酶切鑒定
        2.3.7 SDS-PAGE檢測(cè)HN-VP2融合蛋白的表達(dá)
        2.3.8 Western Blot檢測(cè)結(jié)果
    2.4 討論
第3章 表達(dá)NDV HN和IBDV VP2融合蛋白的重組減毒沙門(mén)菌的構(gòu)建及生物學(xué)特性分析
    3.1 材料
        3.1.1 菌株及質(zhì)粒
        3.1.2 試劑及培養(yǎng)基
        3.1.3 試劑及培養(yǎng)基配制方法
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.5 實(shí)驗(yàn)器材
    3.2 方法
        3.2.1 HN-VP2融合基因的獲取
        3.2.2 重組質(zhì)粒pMD19-T-HN-VP2的構(gòu)建
        3.2.3 重組質(zhì)粒pMD19-T-HN-VP2的鑒定
        3.2.4 重組載體pYA-HN-VP2的構(gòu)建
        3.2.5 沙門(mén)菌（SL1344Δcrp?cya?asd）感受態(tài)的制備
        3.2.6 沙門(mén)菌的電轉(zhuǎn)化
        3.2.7 重組菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)的鑒定
        3.2.8 重組菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)的表型及生化鑒定
        3.2.9 重組菌 SL1344Δcrp?cya?asd (p YA-HN-VP2)的生長(zhǎng)特性測(cè)定
        3.2.10 融合基因在重組菌株中的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)
        3.2.11 重組蛋白在沙門(mén)菌中的表達(dá)及鑒定
        3.2.12 重組菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)對(duì)雛雞的毒力試驗(yàn)
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 重組菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)的PCR鑒定
        3.3.2 重組菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)的雙酶切鑒定
        3.3.3 重組菌SL1344Δcrp?cya?asd (pYA-HN-VP2)的表型及生化鑒定
        3.3.4 重組菌 SL1344Δcrp?cya?asd (p YA-HN-VP2)的生長(zhǎng)曲線測(cè)定
        3.3.5 重組菌的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)
        3.3.6 融合蛋白在重組菌中的表達(dá)
        3.3.7 重組菌株對(duì)雛雞的毒力試驗(yàn)
    3.4 討論
第4章 減毒重組菌SL1344Δcrp?cya?asd(pYA-HN-VP2)的免疫學(xué)特性研究
    4.1 材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要試劑的配制
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        4.1.5 儀器設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 雛雞的免疫
        4.2.2 雛雞免疫后的體重變化
        4.2.3 免疫雛雞的免疫器官指數(shù)測(cè)定
        4.2.4 NDV抗體水平測(cè)定
        4.2.5 間接ELISA法檢測(cè)IBDV VP2抗體水平
        4.2.6 淋巴細(xì)胞增殖活性檢測(cè)
        4.2.7 免疫雛雞消化道sIgA抗體水平的測(cè)定
        4.2.8 免疫雛雞血清中IFN-γ水平的測(cè)定
        4.2.9 免疫雛雞血清中IL-4 水平的測(cè)定
        4.2.10 重組菌株對(duì)雞的免疫保護(hù)效力試驗(yàn)
        4.2.11 數(shù)據(jù)分析
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 雛雞體重變化測(cè)定
        4.3.2 免疫雛雞免疫器官指數(shù)的測(cè)定
        4.3.3 免疫雛雞體內(nèi)新城疫HI抗體水平的測(cè)定
        4.3.4 免疫雛雞體內(nèi)雞傳染性法氏囊VP2抗體水平的測(cè)定
        4.3.5 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)
        4.3.6 免疫雛雞消化道sIgA抗體水平的測(cè)定
        4.3.7 免疫雛雞血清中IFN-γ水平的測(cè)定
        4.3.8 免疫雛雞血清中IL-4 水平的測(cè)定
        4.3.9 重組菌對(duì)雞的免疫保護(hù)效力試驗(yàn)
    4.4 討論
第5章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ 主要儀器設(shè)備
附錄Ⅱ HN-VP2測(cè)序結(jié)果
致謝
碩士期間的研究成果



本文編號(hào)：3949512