本文關(guān)鍵詞：miR-4331對TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞線粒體損傷的調(diào)控作用及機制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：microRNA(miRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的小RNA分子,成熟的miRNA由19~23個核苷酸組成。miRNA通過與靶mRNA 3'非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)結(jié)合,抑制mRNA翻譯或降解mRNA,調(diào)控靶基因的表達水平,從而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用,如參與調(diào)控發(fā)育、細胞凋亡和線粒體損傷等。豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染豬腎細胞(PK-15)可通過線粒體信號通路誘導(dǎo)細胞凋亡,同時,TGEV感染PK-15細胞后,miRNA表達譜發(fā)生了變化,且miR-4331表達量顯著上調(diào)。本論文擬以miR-4331為研究對象,探討其對TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞線粒體損傷的調(diào)控作用及機制。首先檢測mi R-4331對TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞線粒體損傷的作用;其次驗證miR-4331的靶基因,檢測miR-4331靶基因?qū)�粒體損傷的作用;最后檢測mi R-4331及其靶基因?qū)φ{(diào)控線粒體損傷相關(guān)信號通路的作用,闡明miR-4331調(diào)控線粒體損傷的機制。得到如下結(jié)果。1.將miR-4331 mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染至PK-15細胞,再感染TGEV,分別檢測線粒體鈣離子濃度和膜電位,結(jié)果顯示,過表達miR-4331后線粒體鈣離子濃度顯著增加、膜電位顯著降低,抑制miR-4331則線粒體鈣離子濃度顯著降低、膜電位顯著升高,結(jié)果表明,miR-4331促進TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞線粒體損傷。iTRAQ試驗檢測過表達mi R-4331且感染TGEV的PK-15細胞,細胞蛋白表達譜發(fā)生變化,共得到69個差異表達的蛋白,其中33個蛋白表達量上調(diào),36個蛋白表達量下調(diào)。2.利用雙熒光素酶試驗和western blotting驗證miR-4331靶基因。首先將候選靶基因野生型3′UTR以及其突變型3′UTR分別克隆至雙熒光素酶質(zhì)粒psiCHECK-2,構(gòu)建含靶基因野生型3′UTR、突變型3′UTR的雙熒光素酶重組質(zhì)粒;然后將miR-4331 mimics或inhibitors與雙熒光素酶重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至PK-15細胞,檢測miR-4331與靶基因野生型、突變型3′UTR的結(jié)合活性,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-4331 mimics和RB1野生型3′UTR重組質(zhì)粒的細胞,其雙熒光素酶活性顯著降低;而轉(zhuǎn)染miR-4331 inhibitors和RB1野生型3′UTR重組質(zhì)粒的細胞,其雙熒光素酶活性顯著升高。western blotting檢測miR-4331對RB1蛋白表達量的影響,發(fā)現(xiàn)過表達miR-4331抑制RB1的表達。進一步試驗證明,在TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞線粒體損傷過程中,RB1可以下調(diào)線粒體鈣離子濃度、上調(diào)線粒體膜電位,起到減輕線粒體損傷的作用。3.通過對iTRAQ檢測出的差異表達蛋白進行GO注釋和KEGG分析,并利用siRNA(small interfering RNA)沉默RB1基因表達,結(jié)果導(dǎo)致IL1-R和p38的表達量均顯著上調(diào);沉默IL1-R表達后,p38的表達量發(fā)生下調(diào);分別沉默IL1-R和p38的表達,則線粒體鈣離子濃度均表現(xiàn)為下調(diào)和線粒體膜電位均表現(xiàn)為上調(diào)。以上結(jié)果表明,p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控線粒體損傷是miR-4331調(diào)控TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞線粒體損傷的主要信號通路之一。本研究發(fā)現(xiàn)miR-4331促進TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞線粒體損傷,iTRAQ分析發(fā)現(xiàn)mi R-4331過表達導(dǎo)致TGEV感染的PK-15細胞蛋白表達譜發(fā)生變化。雙熒光素酶試驗和western blotting結(jié)果證明RB1是miR-4331的靶基因。還發(fā)現(xiàn)mi R-4331和RB1通過調(diào)控p38 MAPK信號通路而調(diào)控TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞線粒體損傷。研究結(jié)果闡明了mi R-4331在TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞線粒體損傷過程中的作用與調(diào)控機制,為進一步研究宿主細胞mi RNA與TGEV的相互作用提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：豬傳染性胃腸炎病毒 miRNA PK-15細胞 線粒體損傷
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.3
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 前言12-13
• 文獻綜述13-17
• 第一章 miRNA參與調(diào)控線粒體損傷研究進展13-17
• 1.1 miRNA的產(chǎn)生及作用機制13-14
• 1.2 線粒體損傷的特征14
• 1.3 病毒與線粒體損傷14-15
• 1.4 miRNA調(diào)控病毒誘導(dǎo)線粒體損傷15-16
• 1.5 本研究的目的與意義16-17
• 試驗內(nèi)容17-52
• 第二章 miR-4331對TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞線粒體損傷的作用17-34
• 2.1 材料17
• 2.1.1 主要試劑17
• 2.1.2 主要儀器17
• 2.1.3 細胞及毒株17
• 2.2 方法17-23
• 2.2.1 細胞的培養(yǎng)17
• 2.2.2 TGEV細胞半數(shù)感染量（TCID50）的測定17-18
• 2.2.3 miR-4331對線粒體損傷的調(diào)控作用18-22
• 2.2.4 iTRAQ檢測試驗樣品準備22
• 2.2.5 iTRAQ數(shù)據(jù)分析22
• 2.2.6 差異表達蛋白的驗證22-23
• 2.3 結(jié)果23-33
• 2.3.1 miR-4331對TGEV誘導(dǎo)線粒體損傷的作用23-26
• 2.3.2 miR-4331過表達后蛋白質(zhì)組學(xué)分析26-29
• 2.3.3 iTRAQ檢測結(jié)果的生物信息學(xué)分析29-32
• 2.3.4 差異表達蛋白的驗證32-33
• 2.4 討論33
• 2.5 小結(jié)33-34
• 第三章 miR-4331潛在靶基因的驗證及靶基因?qū)�粒體損傷的調(diào)控作用34-45
• 3.1 材料34
• 3.1.1 主要試劑34
• 3.1.2 主要儀器34
• 3.2 方法34-40
• 3.2.1 miR-4331靶基因雙熒光素酶載體的構(gòu)建34-38
• 3.2.2 雙熒光素酶試驗驗證miR-4331的靶基因38
• 3.2.3 western blotting驗證miR-4331靶基因38
• 3.2.4 RB1對TGEV誘導(dǎo)線粒體損傷作用的檢測38-40
• 3.3 結(jié)果40-43
• 3.3.1 雙熒光素酶載體的鑒定40
• 3.3.2 RB1為miR-4331的靶基因40-42
• 3.3.3 RB1對TGEV誘導(dǎo)線粒體損傷的作用42-43
• 3.4 討論43
• 3.5 小結(jié)43-45
• 第四章 miR-4331通過p38 MAPK信號通路對線粒體損傷的調(diào)控作用45-52
• 4.1 材料45
• 4.1.1 主要試劑45
• 4.1.2 主要儀器45
• 4.2 方法45-47
• 4.2.1 p38 MAPK信號通路對線粒體損傷調(diào)控作用的檢測45-46
• 4.2.2 miR-4331對p38 MAPK信號通路調(diào)控作用的檢測46-47
• 4.2.3 RB1對p38 MAPK信號通路調(diào)控作用的檢測47
• 4.3 結(jié)果47-50
• 4.3.1 IL1-R和p38對TGEV誘導(dǎo)線粒體損傷的作用47-48
• 4.3.2 IL1-R調(diào)控p38的表達48-49
• 4.3.3 miR-4331調(diào)控p38 MAPK信號通路49
• 4.4.4 RB1調(diào)控p38 MAPK信號通路49-50
• 4.4 討論50-51
• 4.5 小結(jié)51-52
• 結(jié)論與創(chuàng)新點52-53
• 參考文獻53-57
• 縮略詞57-58
• 致謝58-59
• 作者簡介59

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1 鄭柯文,俞慶森,曾敏,馬國正,王艷花,張兵;靜電和疏水效應(yīng)對TGEV主蛋白酶二聚體穩(wěn)定性的影響[J];物理化學(xué)學(xué)報;2004年06期

2 葛晨霞;王龍濤;馬磊;胡桂學(xué);;豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)檢測技術(shù)研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2010年12期

3 修晶輝;李偉娜;尹鑫;劉寧;魏萍;;一株仔豬腸道益生菌抗TGEV作用初探[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2012年03期

4 王劭;朱小麗;朱曉琳;陳少鶯;林鋒強;陳仕龍;程曉霞;李兆龍;江斌;;豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)福建分離株核衣殼蛋白基因(N)的克隆與表達分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2013年01期

5 魯娜;宋陽;劉瑩;胡桂學(xué);;TGEV S基因原核表達及表達蛋白間接ELISA方法的建立與初步應(yīng)用[J];黑龍江畜牧獸醫(yī);2013年01期

6 任曉峰;佟玲;孫雪嬌;趙高偉;王婧婧;高明;;豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)種毒特性研究[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2013年06期

7 查紅波;豬呼吸道冠狀病毒感染[J];中國動物保健;2003年11期

8 房紅瑩;竇守強;羅滿林;;豬呼吸道冠狀病毒研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī)文摘;2007年06期

9 唐芳;何孔旺;侯繼波;姜平;;豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)S蛋白5'端基因重組腺病毒的構(gòu)建及其免疫特性[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2009年01期

10 雷用東;王丹;童軍茂;馬越;張莉;趙曉燕;;接骨木花色苷組成及抗豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)活性分析[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2013年10期

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1 鄒勇;周燕;王建超;華平;何錫忠;蘇萬國;唐永蘭;錢永清;;應(yīng)用微載體技術(shù)生產(chǎn)TGEV試驗研究[A];第六屆全國會員代表大學(xué)暨第11次學(xué)術(shù)研討會論文集（下）[C];2005年

2 鄒勇;周燕;王建超;華平;何錫忠;蘇萬國;唐永蘭;錢永清;;應(yīng)用微載體技術(shù)生產(chǎn)TGEV試驗研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第六屆全國會員代表大會暨第11次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2005年

3 ;Inhibition of porcine Transmissible gastroenteritis virus (TGEV) replication in mini-pigs by shRNA[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第八次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

4 楊百亮;馮力;趙翠萍;孫東波;張建斌;;抗豬傳染性胃腸炎病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株的建立[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會暨中國免疫學(xué)會獸醫(yī)免疫分會第七次研討會論文集[C];2008年

5 周燕;王建超;華平;鄒勇;譚文松;;豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)在ST細胞中的增殖規(guī)律[A];第一屆全國化學(xué)工程與生物化工年會論文摘要集(下)[C];2004年

6 俞伏松;王劭;陳仕龍;程曉霞;黃梅清;江斌;邵良平;陳少鶯;;豬傳染性胃腸炎病毒福建株的分離與鑒定[A];2012年福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)術(shù)年會論文集[C];2012年

7 李霞;張春紅;趙亞華;張建峰;;TGEV和PEDV多重RT-PCR檢測方法的建立及其細胞分離培養(yǎng)研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2010年

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9 黃小波;曹三杰;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒檢測基因芯片的初步構(gòu)建[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2006學(xué)術(shù)年會論文集（下冊）[C];2006年

10 李娜;黃小波;曹三杰;文心田;;豬傳染性胃腸炎病毒重組N蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會動物傳染病學(xué)分會第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2008年

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1 馬瑞麗;豬傳染性胃腸炎病毒感染ST細胞差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

2 胡曉亮;豬傳染性胃腸炎病毒HX株的分離與鑒定及其PL蛋白對抗IFN-β的分子機制[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 宋祥軍;microRNA在TGEV感染PK-15細胞過程中的作用與調(diào)控機制[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

4 蘭喜;豬傳染性胃腸炎病毒的分子診斷與免疫研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2006年

5 丁利;TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

6 安康;TGEV感染PK-15細胞的蛋白質(zhì)組學(xué)及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的分子機制[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 王龍濤;豬傳染性胃腸炎病毒纖突蛋白基因體外克隆表達及鑒定[D];吉林大學(xué);2010年

8 彭樹英;TGEV S基因的克隆、表達及轉(zhuǎn)基因小鼠的制備[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

9 楊恒;豬傳染性胃腸炎病毒DNA疫苗的構(gòu)建與免疫原性研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

10 周俊芳;shRNA表達載體抗豬傳染性胃腸炎病毒感染的研究[D];上海交通大學(xué);2007年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王雪;TGEV S-AD蛋白親和肽的篩選及鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

2 張清真;豬病毒性腹瀉病原ELISA及Luminex檢測方法研究[D];上海海洋大學(xué);2015年

3 徐靜;豬傳染性胃腸炎病毒分離及部分特性鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 王瑩瑩;嗜酸乳桿菌胞外多糖對TGEV感染ST細胞TLR3及部分細胞因子表達的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

5 高睿澤;豬傳染性胃腸炎病毒RT-LAMP檢測方法的建立及初步應(yīng)用[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

6 田宗民;抑致病菌益生菌菌株及其胞外多糖抗TGEV作用的比較分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

7 杜彩虹;豬冠狀病毒性腹瀉RT-PCR檢測及豬傳染性胃腸炎病毒分離鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 李蕊彤;豬傳染性胃腸炎病毒N基因的熒光定量PCR檢測方法建立及初步應(yīng)用[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 魏浩澈;重組豬干擾素α抗豬傳染性胃腸炎病毒的研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 張莉娟;豬樹突狀細胞在豬傳染性胃腸炎病毒感染中的作用及機制研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：miR-4331對TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞線粒體損傷的調(diào)控作用及機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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