本文關(guān)鍵詞：miR-4331對(duì)TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞線粒體損傷的調(diào)控作用及機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：microRNA(miRNA)是一類不編碼蛋白質(zhì)的小RNA分子,成熟的miRNA由19~23個(gè)核苷酸組成。miRNA通過(guò)與靶mRNA 3'非翻譯區(qū)(untranslated region,UTR)結(jié)合,抑制mRNA翻譯或降解mRNA,調(diào)控靶基因的表達(dá)水平,從而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用,如參與調(diào)控發(fā)育、細(xì)胞凋亡和線粒體損傷等。豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染豬腎細(xì)胞(PK-15)可通過(guò)線粒體信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí),TGEV感染PK-15細(xì)胞后,miRNA表達(dá)譜發(fā)生了變化,且miR-4331表達(dá)量顯著上調(diào)。本論文擬以miR-4331為研究對(duì)象,探討其對(duì)TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞線粒體損傷的調(diào)控作用及機(jī)制。首先檢測(cè)mi R-4331對(duì)TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞線粒體損傷的作用;其次驗(yàn)證miR-4331的靶基因,檢測(cè)miR-4331靶基因?qū)�粒體損傷的作用;最后檢測(cè)mi R-4331及其靶基因?qū)φ{(diào)控線粒體損傷相關(guān)信號(hào)通路的作用,闡明miR-4331調(diào)控線粒體損傷的機(jī)制。得到如下結(jié)果。1.將miR-4331 mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染至PK-15細(xì)胞,再感染TGEV,分別檢測(cè)線粒體鈣離子濃度和膜電位,結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-4331后線粒體鈣離子濃度顯著增加、膜電位顯著降低,抑制miR-4331則線粒體鈣離子濃度顯著降低、膜電位顯著升高,結(jié)果表明,miR-4331促進(jìn)TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞線粒體損傷。iTRAQ試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)mi R-4331且感染TGEV的PK-15細(xì)胞,細(xì)胞蛋白表達(dá)譜發(fā)生變化,共得到69個(gè)差異表達(dá)的蛋白,其中33個(gè)蛋白表達(dá)量上調(diào),36個(gè)蛋白表達(dá)量下調(diào)。2.利用雙熒光素酶試驗(yàn)和western blotting驗(yàn)證miR-4331靶基因。首先將候選靶基因野生型3′UTR以及其突變型3′UTR分別克隆至雙熒光素酶質(zhì)粒psiCHECK-2,構(gòu)建含靶基因野生型3′UTR、突變型3′UTR的雙熒光素酶重組質(zhì)粒;然后將miR-4331 mimics或inhibitors與雙熒光素酶重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至PK-15細(xì)胞,檢測(cè)miR-4331與靶基因野生型、突變型3′UTR的結(jié)合活性,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-4331 mimics和RB1野生型3′UTR重組質(zhì)粒的細(xì)胞,其雙熒光素酶活性顯著降低;而轉(zhuǎn)染miR-4331 inhibitors和RB1野生型3′UTR重組質(zhì)粒的細(xì)胞,其雙熒光素酶活性顯著升高。western blotting檢測(cè)miR-4331對(duì)RB1蛋白表達(dá)量的影響,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-4331抑制RB1的表達(dá)。進(jìn)一步試驗(yàn)證明,在TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞線粒體損傷過(guò)程中,RB1可以下調(diào)線粒體鈣離子濃度、上調(diào)線粒體膜電位,起到減輕線粒體損傷的作用。3.通過(guò)對(duì)iTRAQ檢測(cè)出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO注釋和KEGG分析,并利用siRNA(small interfering RNA)沉默RB1基因表達(dá),結(jié)果導(dǎo)致IL1-R和p38的表達(dá)量均顯著上調(diào);沉默IL1-R表達(dá)后,p38的表達(dá)量發(fā)生下調(diào);分別沉默IL1-R和p38的表達(dá),則線粒體鈣離子濃度均表現(xiàn)為下調(diào)和線粒體膜電位均表現(xiàn)為上調(diào)。以上結(jié)果表明,p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控線粒體損傷是miR-4331調(diào)控TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞線粒體損傷的主要信號(hào)通路之一。本研究發(fā)現(xiàn)miR-4331促進(jìn)TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞線粒體損傷,iTRAQ分析發(fā)現(xiàn)mi R-4331過(guò)表達(dá)導(dǎo)致TGEV感染的PK-15細(xì)胞蛋白表達(dá)譜發(fā)生變化。雙熒光素酶試驗(yàn)和western blotting結(jié)果證明RB1是miR-4331的靶基因。還發(fā)現(xiàn)mi R-4331和RB1通過(guò)調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路而調(diào)控TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞線粒體損傷。研究結(jié)果闡明了mi R-4331在TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞線粒體損傷過(guò)程中的作用與調(diào)控機(jī)制,為進(jìn)一步研究宿主細(xì)胞mi RNA與TGEV的相互作用提供理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：豬傳染性胃腸炎病毒 miRNA PK-15細(xì)胞 線粒體損傷
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.3
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 前言12-13
• 文獻(xiàn)綜述13-17
• 第一章 miRNA參與調(diào)控線粒體損傷研究進(jìn)展13-17
• 1.1 miRNA的產(chǎn)生及作用機(jī)制13-14
• 1.2 線粒體損傷的特征14
• 1.3 病毒與線粒體損傷14-15
• 1.4 miRNA調(diào)控病毒誘導(dǎo)線粒體損傷15-16
• 1.5 本研究的目的與意義16-17
• 試驗(yàn)內(nèi)容17-52
• 第二章 miR-4331對(duì)TGEV誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞線粒體損傷的作用17-34
• 2.1 材料17
• 2.1.1 主要試劑17
• 2.1.2 主要儀器17
• 2.1.3 細(xì)胞及毒株17
• 2.2 方法17-23
• 2.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)17
• 2.2.2 TGEV細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50）的測(cè)定17-18
• 2.2.3 miR-4331對(duì)線粒體損傷的調(diào)控作用18-22
• 2.2.4 iTRAQ檢測(cè)試驗(yàn)樣品準(zhǔn)備22
• 2.2.5 iTRAQ數(shù)據(jù)分析22
• 2.2.6 差異表達(dá)蛋白的驗(yàn)證22-23
• 2.3 結(jié)果23-33
• 2.3.1 miR-4331對(duì)TGEV誘導(dǎo)線粒體損傷的作用23-26
• 2.3.2 miR-4331過(guò)表達(dá)后蛋白質(zhì)組學(xué)分析26-29
• 2.3.3 iTRAQ檢測(cè)結(jié)果的生物信息學(xué)分析29-32
• 2.3.4 差異表達(dá)蛋白的驗(yàn)證32-33
• 2.4 討論33
• 2.5 小結(jié)33-34
• 第三章 miR-4331潛在靶基因的驗(yàn)證及靶基因?qū)�粒體損傷的調(diào)控作用34-45
• 3.1 材料34
• 3.1.1 主要試劑34
• 3.1.2 主要儀器34
• 3.2 方法34-40
• 3.2.1 miR-4331靶基因雙熒光素酶載體的構(gòu)建34-38
• 3.2.2 雙熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證miR-4331的靶基因38
• 3.2.3 western blotting驗(yàn)證miR-4331靶基因38
• 3.2.4 RB1對(duì)TGEV誘導(dǎo)線粒體損傷作用的檢測(cè)38-40
• 3.3 結(jié)果40-43
• 3.3.1 雙熒光素酶載體的鑒定40
• 3.3.2 RB1為miR-4331的靶基因40-42
• 3.3.3 RB1對(duì)TGEV誘導(dǎo)線粒體損傷的作用42-43
• 3.4 討論43
• 3.5 小結(jié)43-45
• 第四章 miR-4331通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)線粒體損傷的調(diào)控作用45-52
• 4.1 材料45
• 4.1.1 主要試劑45
• 4.1.2 主要儀器45
• 4.2 方法45-47
• 4.2.1 p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)線粒體損傷調(diào)控作用的檢測(cè)45-46
• 4.2.2 miR-4331對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路調(diào)控作用的檢測(cè)46-47
• 4.2.3 RB1對(duì)p38 MAPK信號(hào)通路調(diào)控作用的檢測(cè)47
• 4.3 結(jié)果47-50
• 4.3.1 IL1-R和p38對(duì)TGEV誘導(dǎo)線粒體損傷的作用47-48
• 4.3.2 IL1-R調(diào)控p38的表達(dá)48-49
• 4.3.3 miR-4331調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路49
• 4.4.4 RB1調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路49-50
• 4.4 討論50-51
• 4.5 小結(jié)51-52
• 結(jié)論與創(chuàng)新點(diǎn)52-53
• 參考文獻(xiàn)53-57
• 縮略詞57-58
• 致謝58-59
• 作者簡(jiǎn)介59

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本文編號(hào)：394690