發(fā)布時間：2024-03-05 02:24

　　乳脂肪是牛奶的主要營養(yǎng)成分,可以為人類提供營養(yǎng)和能量,因此生產(chǎn)具有足夠乳脂肪的優(yōu)質(zhì)牛奶是健康食品的發(fā)展趨勢。然而我國牛奶中乳脂肪的含量普遍偏低,削弱了乳制品在國內(nèi)外市場的競爭力,因此提高乳產(chǎn)量及乳脂肪含量成為我們亟待解決的問題。奶牛乳脂肪合成的前體物主要是乙酸和p-羥丁酸,還有乳腺從血液攝取的長鏈脂肪酸,以前的研究主要側(cè)重于脂肪酸對奶牛生產(chǎn)性能的影響,而有關(guān)脂肪酸與乳腺乳脂肪合成功能基因相互作用的研究較少。 本課題首先利用qRT-PCR和Western blotting篩選干奶期奶牛、低乳品質(zhì)奶牛和高乳品質(zhì)奶牛乳腺組織與乳脂肪合成相關(guān)的差異表達基因和差異表達蛋白,作為后續(xù)體外實驗的評價指標。采用組織塊培養(yǎng)法構(gòu)建奶牛乳腺上皮細胞(DCMECs)模型。DCMECs添加乙酸鈉、p-羥基丁酸鈉、乙酸鈉和p-羥基丁酸鈉混合物、軟脂酸和硬脂酸,qRT-PCR檢測DCMECs脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運、活化相關(guān)蛋白基因(CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2)、脂肪酸從頭合成、去飽和酶基因(ACC、FAS、SCD)、甘油三酯合成酶相關(guān)基因(GPAT、AGPAT6、DGAT1)和乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(P...

【文章頁數(shù)】：150 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 乳脂肪合成機理
        1.1.1 乳脂肪的組成
        1.1.2 乳脂肪酸的組成
        1.1.3 乳脂肪酸的來源
        1.1.4 乳脂肪合成代謝途徑
    1.2 乳脂肪降低理論
        1.2.1 葡萄糖生成-胰島素理論
        1.2.2 反式脂肪酸理論
        1.2.3 生物氫化作用理論
    1.3. 脂肪合成的轉(zhuǎn)錄因子
        1.3.1 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白
        1.3.2 過氧化物酶體增殖物激活受體
        1.3.3 肝臟X受體
        1.3.4 乳脂肪合成的轉(zhuǎn)錄因子
    1.4 脂肪酸對乳脂肪合成的調(diào)節(jié)
    1.5 本研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗試劑和儀器
        2.1.1 實驗試劑
        2.1.2 實驗儀器
    2.2 奶牛乳腺組織乳脂肪合成相關(guān)基因和蛋白表達檢測
        2.2.1 實驗動物選取
        2.2.2 奶牛乳腺組織收集及總RNA提取
        2.2.3 qRT-PCR檢測乳脂肪合成相關(guān)基因表達
        2.2.4 Western blotting檢測乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和相關(guān)蛋白表達
    2.3 奶牛乳腺上皮細胞(DCMECs)的原代培養(yǎng)及鑒定
        2.3.1 奶牛乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)及純化
        2.3.2 奶牛乳腺上皮細胞的鑒定
    2.4 脂肪酸對DCMECs乳脂肪合成影響的檢測
        2.4.1 脂肪酸的最佳作用濃度篩選
        2.4.2 脂肪酸作用DCMECs后乳脂肪合成相關(guān)基因表達的檢測
        2.4.3 脂肪酸作用DCMECs后乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)蛋白表達的檢測
        2.4.4 脂肪酸作用DCMECs后乳脂肪合成關(guān)鍵酶活性的檢測
    2.5 細胞免疫熒光法進行乳脂肪合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ定位分析
    2.6 脂肪酸添加對PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測
        2.6.1 脂肪酸的最佳作用濃度篩選
        2.6.2 乳脂肪合成相關(guān)基因表達的檢測
        2.6.3 乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄因子表達的檢測
        2.6.4 乳脂肪合成關(guān)鍵酶活性的檢測
    2.7 脂肪酸添加對PPARγ基因超表達DCMECs乳脂肪合成影響的檢測
        2.7.1 引物設(shè)計及PPARγ基因擴增
        2.7.2 PPARγ基因PCR擴增產(chǎn)物克隆載體構(gòu)建
        2.7.3 真核表達載體pGCMV/IRES/EGFP/PPARγ的構(gòu)建
        2.7.4 脂肪酸的最佳作用濃度篩選
        2.7.5 乳脂肪合成相關(guān)基因表達的檢測
        2.7.6 乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄因子表達的檢測
        2.7.7 乳脂肪合成關(guān)鍵酶活性的檢測
    2.8 數(shù)據(jù)處理
3 結(jié)果與分析
    3.1 奶牛乳腺組織乳脂肪合成相關(guān)基因和相關(guān)蛋白表達檢測結(jié)果
        3.1.1 奶牛乳腺組織乳脂肪合成相關(guān)基因表達結(jié)果
        3.1.2 奶牛乳腺組織乳脂肪合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和相關(guān)蛋白表達結(jié)果
    3.2 奶牛乳腺上皮細胞原代培養(yǎng)及鑒定
    3.3 脂肪酸對DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.3.1 乙酸鈉對DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.3.2 β-羥基丁酸鈉對DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.3.3 乙酸鈉和β-羥基丁酸鈉協(xié)同作用對DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.3.4 軟脂酸對DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.3.5 硬脂酸對DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
    3.4 乳脂肪合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ定位分析
    3.5 脂肪酸對PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.5.1 PPARγ RNA沉寂效率
        3.5.2 乙酸鈉對PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.5.3 β-羥基丁酸鈉對PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.5.4 乙酸鈉和β-羥基丁酸鈉協(xié)同作用對PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.5.5 軟脂酸對PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.5.6 硬脂酸對PPARγ基因沉寂DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
    3.6 脂肪酸對PPARγ基因超表達DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.6.1 PPARγ的PCR擴增結(jié)果及重組質(zhì)粒pGCMV/IRES/EGFP/PPARγ的驗證
        3.6.2 PPARγ超表達效率
        3.6.3 乙酸鈉對PPARγ基因超表達DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.6.4 β-羥基丁酸鈉對PPARγ基因超表達DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.6.5 乙酸鈉和β-羥基丁酸鈉協(xié)同作用對PPARγ基因超表達DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.6.6 軟脂酸對PPARγ基因超表達DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
        3.6.7 硬脂酸對PPARγ基因超表達DCMECs乳脂肪合成影響的檢測結(jié)果
    3.7 脂肪酸與PPARγ基因互作對DCMECs乳脂肪合成的調(diào)節(jié)作用示意圖
4 討論
    4.1 不同泌乳質(zhì)量奶牛乳腺組織乳脂肪合成相關(guān)基因表達和蛋白表達分析
    4.2 脂肪酸對DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.1 乙酸鈉對DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.2 β-羥基丁酸鈉對DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.3 乙酸鈉和β-羥基丁酸鈉協(xié)同作用對DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.4 軟脂酸對DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.5 硬脂酸對DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.2.6 脂肪酸對DCMECs乳脂肪合成相關(guān)基因表達的調(diào)節(jié)作用
    4.3 PPARγ細胞內(nèi)定位分析
    4.4 PPARγ基因沉寂和超表達對DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.4.1 PPARγ基因沉寂對DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.4.2 PPARγ基因超表達對DCMECs乳脂肪合成的影響
    4.5 脂肪酸對PPARγ基因沉寂和超表達DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.5.1 乙酸鈉對PPARγ基因沉寂和超表達DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.5.2 β-羥基丁酸鈉對PPARγ基因沉寂和超表達DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.5.3 乙酸鈉和β-羥基丁酸鈉協(xié)同作用對PPARγ基因沉寂和超表達DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.5.4 軟脂酸對PPARγ基因沉寂和超表達DCMECs乳脂肪合成的影響
        4.5.5 硬脂酸對PPARγ基因沉寂和超表達DCMECs乳脂肪合成的影響
5 結(jié)論
致謝
參考文獻
附錄
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3919526