發(fā)布時(shí)間：2024-03-02 08:22

　　旨在克隆鑒定牦牛lncFAM200B,為探索其在牦牛肌肉和脂肪發(fā)育過程中的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)。以臀肌cDNA為模板,設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增lncFAM200B全長序列,用在線軟件CPC、CPAT對(duì)該lncRNA的編碼能力進(jìn)行預(yù)測(cè),進(jìn)一步通過原核表達(dá)試驗(yàn)鑒定其編碼能力;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)對(duì)lncFAM200B進(jìn)行組織表達(dá)分析,通過TargetScan 7.1和miRanda預(yù)測(cè)與lncFAM200B具有潛在相互作用miRNA的靶基因,利用DAVID在線軟件對(duì)靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析。結(jié)果顯示,牦牛lncFAM200B長度為531 bp;相較于普通牛多59 bp,編碼潛能為-1.287 4,且原核表達(dá)試驗(yàn)驗(yàn)證該lncRNA不具備蛋白編碼能力,表明牦牛lncFAM200B確為lncRNA;組織表達(dá)譜研究表明,lncFAM200B在牦牛肺臟組織中表達(dá)量較高。與lncFAM200B具有潛在相互作用miRNA的靶基因,如Sirt1、SCD5、KLF9、PTEN和MYPN等,與肌肉和脂肪發(fā)育相關(guān)。為進(jìn)一步探討牦牛lncFAM200B在肌肉和脂肪發(fā)育中的生物學(xué)功能提供參考依據(jù)。

【文章頁數(shù)】：11 頁

【部分圖文】：

圖1克隆引物位置示意圖

采用PrimerPremier5.0軟件,根據(jù)張思?xì)g[18]研究所得lncFAM200B序列設(shè)計(jì)克隆引物,克隆引物在牦�；蚪M中的位置如圖1所示。以克隆所得全長序列為模板設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物,內(nèi)參基因選擇GAPDH(NM_001034034.2)、UXT(NM_0010....

圖2lncFAM200BPCR擴(kuò)增結(jié)果

以牦牛臀肌cDNA為模板,PCR擴(kuò)增后經(jīng)電泳檢測(cè)獲得單一目的條帶(圖2)。測(cè)序結(jié)果表明,lncFAM200B全長大小為531bp。2.2lncFAM200B序列分析

圖3牦牛與普通牛lncFAM200B序列比對(duì)結(jié)果

利用NCBI-OpenReadingFrameFinder預(yù)測(cè)lncFAM200B開放閱讀框,得到35條預(yù)測(cè)結(jié)果,其中最長的開放閱讀框包含174個(gè)堿基,編碼57個(gè)氨基酸,小于一般編碼基因的氨基酸數(shù)(100aa),而該lncRNA長度大于200nt,說明lncFAM200....

圖4lncFAM200B原核表達(dá)載體雙酶切鑒定

經(jīng)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE分析結(jié)果顯示(圖5),lncFAM200B-28a與陰性對(duì)照,即空載pET-28a表達(dá)情況一致,相同試驗(yàn)條件下,陽性對(duì)照CSN3-28a成功表達(dá)25.32ku左右的蛋白(CSN3表達(dá)21.58ku蛋白,載體可表達(dá)3.74ku蛋....

本文編號(hào)：3916592