坦布蘇病毒(Tembusu Virus,TMUV)是一種新型黃病毒,于2010年在我國首次爆發(fā)。其傳播迅速,可感染蛋鴨、種鴨和鵝等多種水禽,發(fā)病禽場的感染率常高達(dá)100%。目前,TMUV感染已成為危害我國水禽養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病之一。外泌體是一種由細(xì)胞產(chǎn)生的膜性囊泡,在機(jī)體多種生理病理過程中發(fā)揮著物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞的作用。某些病毒感染細(xì)胞源外泌體中包含病毒核酸及蛋白等成分,能介導(dǎo)細(xì)胞感染,協(xié)助病毒進(jìn)行免疫逃逸,在病毒感染過程中發(fā)揮重要作用。而目前對TMUV感染細(xì)胞源外泌體特性尚不清楚。本研究對TMUV感染細(xì)胞源外泌體的提取方案進(jìn)行了優(yōu)化,具體從細(xì)胞選取、維持時(shí)間確立和提取方法確立三個(gè)方面展開。研究對比了三種TMUV研究常用的細(xì)胞:HEK293細(xì)胞、C6/36細(xì)胞和DEF細(xì)胞接毒后的外泌體生成量,BCA蛋白濃度測定結(jié)果顯示,HEK293細(xì)胞上清中提取的外泌體蛋白濃度最高,因此選用HEK293細(xì)胞作為外泌體制備用細(xì)胞。對細(xì)胞接毒后維持36 h和48 h的上清中外泌體進(jìn)行比較,BCA蛋白濃度測定結(jié)果顯示,維持48 h的細(xì)胞上清中外泌體的蛋白含量僅略高于維持36 h的細(xì)胞上清中外泌體蛋白含量,因此...

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖1外泌體提取流程

3000g離心10min，收集管底部液體，于-80℃保存?zhèn)溆�。具體流程見圖1B。3)超濾離心結(jié)合試劑盒沉淀法：將處理好的上清分裝至NMWL為100kDa的超濾離心管過濾裝置中，配平后以4℃，3500g離心10min。離心結(jié)束后加入PBS重懸，后再次....

圖2細(xì)胞病變及IFA檢測結(jié)果

浮和死亡等病變，IFA檢測顯示細(xì)胞質(zhì)發(fā)出綠色熒光（圖2），表明病毒具有感染C6/36細(xì)胞的能力。

圖3TMUVPCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3TMUVPCR擴(kuò)增結(jié)果A：細(xì)胞上清；B：陽性對照igure3PCRamplificationresultsofTMUVA:Supernatant;B:Positivecontrol結(jié)果表7，通過Reed-Muench法表7病毒TCID5....

圖4不同細(xì)胞產(chǎn)生外泌體蛋白含量測定Figure4Determinationoftheproteinconcentrationofdifferentcells-derivedexosomes

布蘇病毒感染細(xì)胞源外泌體的提取鑒定及特性研優(yōu)化結(jié)果EF細(xì)胞，HEK293細(xì)胞和C6/36細(xì)每個(gè)樣品重復(fù)提取且測定三次。結(jié)果外泌體的蛋白量顯著高于C6/36細(xì)K293細(xì)胞的外泌體產(chǎn)量最高，因此。

本文編號：3915928