miRNA對(duì)細(xì)胞的增殖和分化以及不同階段的肌肉發(fā)育都有著十分重要的調(diào)節(jié)作用，本研究構(gòu)建了豬miRNA-378過(guò)表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞系（PEF,porcine embryo fibroblast），在細(xì)胞水平驗(yàn)證過(guò)表達(dá)載體的表達(dá)效率。利用原核顯微注射技術(shù)制備轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)分子生物學(xué)方法分析轉(zhuǎn)基因小鼠的整合效率及表達(dá)效率，并對(duì)miRNA-378在轉(zhuǎn)基因小鼠上的生物學(xué)功能進(jìn)行初步分析。 從大白豬（sus scrofa）基因組的DNA上擴(kuò)增miRNA-378擴(kuò)增前體序列，通過(guò)XhoI酶切后回收相應(yīng)片段，連接到pEGP-miR載體中，成功構(gòu)建重組載體pEGP-miR-378并轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞系（PEF,porcine embryo fibroblast）,通過(guò)熒光觀察轉(zhuǎn)染效率及報(bào)告基因的表達(dá)效率，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QRT-PCR）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)miRNA-378的表達(dá)活性。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組載體pEGP-miR-378；熒光觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，顯示有較高的轉(zhuǎn)染效率，報(bào)告基因有較高的表達(dá)效率；QRT-PCR結(jié)果顯示，試驗(yàn)組較對(duì)照組miRNA-378表達(dá)顯著提高，試驗(yàn)組較對(duì)...

【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1：let-7RNA表達(dá)情況的比較

圖1：let-7RNA表達(dá)情況的比較Fig.1Comparisonoflet-7RNAexpression（PasquinelliAE,ReinhareBJ,SlackF,etal.,Conservationofthesequenceand....

圖2：動(dòng)物miRNA的生物合成過(guò)程

3圖2：動(dòng)物miRNA的生物合成過(guò)程Fig2:ThebiogenesisofanimalmiRNAslDP.miRNAsgenomics,biogenesis,mechanism,andfunctio結(jié)構(gòu)保守性多數(shù)miRNA來(lái)看，他們中大部分都是發(fā)....

圖3小鼠肌肉發(fā)生模式圖

Hong2009）。這些由病毒編碼的miRNA與宿主基因組不具有同源性，而且至今它們的功能尚不清楚。與之相反的，在細(xì)胞的培養(yǎng)的過(guò)程中，一種由細(xì)胞編碼的miRNA-miR-32對(duì)PFV-1（primatefoamyvirustype1）的增殖進(jìn)行調(diào)控（Hendr....

圖4：原核顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因羊Fig4:Productionoftransgenicsheepwithpronuclearmicroinjection(Clark,J,Whitelaw,B.,etal.Afuturefortransgeniclivestock.NatRevGenet,2003)

動(dòng)物中到目前為止，可能并不能得到應(yīng)用，目前敲除、插入轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞的是應(yīng)用較為普遍的（Zhou2003）。1.4.2常見(jiàn)的動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的技術(shù)1.4.2.1顯微原核注射法顯微原核注射法是目前很成熟的一種獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其基本操作：在顯微鏡下，將外源目的基因采用微吸管，注....

本文編號(hào)：3899579