為建立一種能同時檢測雞毒支原體和雞滑液囊支原體的雙重PCR方法,根據(jù)MG gapA基因和MS vlhA基因設(shè)計合成特異性引物,通過對雙重PCR擴增條件的優(yōu)化,建立能夠同時檢測MG和MS的雙重PCR方法。結(jié)果顯示,雙重PCR反應條件中最適退火溫度為58℃,反應體系中最適模板濃度為5.76ng/μL,最適引物量為1.25μL(10mmol/L)。特異性試驗顯示,所建PCR方法對MG、MS、MG/MS混合培養(yǎng)物均可擴增出相應的特異性條帶,而對AIV疫苗、NDV疫苗、MO、E.coli、SE的基因組擴增結(jié)果均為陰性;敏感性試驗顯示,該方法對MS、MG最低檢出核酸終濃度分別為0.045ng/μL和0.09ng/μL;臨床應用性試驗顯示,所建立的雙重PCR方法可同時有效地檢測出MG和MS核酸。結(jié)果表明,該雙重PCR具有良好的特異性、敏感性、臨床應用性,可以用于臨床病料中MG和MS的快速檢測,為MG和MS感染的診斷和流行病學監(jiān)測提供了一種簡便適用的方法。

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圖3雙重PCR擴增結(jié)果

圖2MS單項PCR擴增結(jié)果2.3雙重PCR反應條件優(yōu)化結(jié)果

圖1MG單項PCR擴增結(jié)果

應用MGP1/P2、MSP3/P4引物分別建立單項PCR體系對MG、MS、MG/MS混合物進行擴增，結(jié)果見圖1和圖2。由圖1可見，MGP1/P2引物對MG、MG/MS混合物均可擴增出372bp的特異性條帶，條帶大小與預期相符，而對MS、陰性對照未擴增出任何條帶。由圖2可見，MS....

圖2MS單項PCR擴增結(jié)果

應用MGP1/P2、MSP3/P4引物建立雙重PCR體系對MG、MS、MG/MS混合物進行擴增，結(jié)果見圖3。由圖3可見，在陰性對照成立條件下，P1、P2、P3、P4混合引物對MG擴增出372bp特異性條帶，對MS擴增出1046bp特異性條帶，對MG/MS混合物可同時擴增出372....

圖4雙重PCR溫度優(yōu)化結(jié)果

基于雙重PCR初體系對雙重PCR的的反應條件進行優(yōu)化，結(jié)果見圖4、圖5和圖6。由圖4可見，雙重PCR退火溫度為58℃，由圖5可見泳道4、5擴增條帶一致，所以選擇模板終濃度為5.76ng/μL；由圖6可見，引物P1、P2、P3、P4(10mmol/L）用量均為1.25μL。圖5雙....

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