嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)是細(xì)菌在遭受環(huán)境壓力和營(yíng)養(yǎng)不足時(shí),為了生存必須快速感知和適應(yīng)不斷變化的環(huán)境而發(fā)生的調(diào)控反應(yīng)。研究嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)對(duì)于掌握細(xì)菌的生存機(jī)制以及掌握感染動(dòng)物的發(fā)病機(jī)制有著重要的研究意義。細(xì)菌的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)是由(p)ppGpp信號(hào)分子介導(dǎo)的,該信號(hào)分子是由細(xì)菌的RSH (RelA/SpoT Homologue)蛋白質(zhì)催化合成。豬鏈球菌2型(SS2)基因組編碼2個(gè)(p)ppGpp合成酶RelA和RelQ, RelA含有1個(gè)(p)ppGpp合成結(jié)構(gòu)域(RSD)、1個(gè)(p)ppGpp水解結(jié)構(gòu)域(HD)及2個(gè)與調(diào)控相關(guān)的結(jié)構(gòu)域(TGS和ACT),而RelQ只含有1個(gè)(p)ppGpp合成結(jié)構(gòu)域(RSD)。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn),RelA單獨(dú)負(fù)責(zé)葡萄糖饑餓時(shí)SS2的(p)ppGpp合成,而RelA和RelQ共同參與氨基酸饑餓和鐵饑餓時(shí)SS2的(p)ppGpp合成。一般認(rèn)為,RelA/RelQ是通過與核糖體相互作用來調(diào)控其(p)ppGpp合成或水解活性的。鑒于RelA和RelQ的結(jié)構(gòu)和功能的差異,我們推測(cè)它們可能與核糖體亞基存在不同的相互作用。為此,開展了豬鏈球菌2型RelA和RelQ與核糖體亞基相互作用的研究...

【文章頁(yè)數(shù)】：71 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 豬鏈球菌概述
    1.2 嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)
        1.2.1 概述
        1.2.2 (p)ppGpp的代謝及調(diào)控
        1.2.3 (p)ppGpp與轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        1.2.4 (p)ppGpp與翻譯調(diào)控
        1.2.5 (p)ppGpp對(duì)細(xì)菌生理機(jī)能的影響
    1.3 RelA與RelQ的關(guān)系研究
2 研究目的與意義
3 材料與方法
    3.1 菌株和質(zhì)粒
    3.2 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑
        3.2.1 主要試劑
        3.2.2 常用培養(yǎng)基和抗生素
        3.2.3 細(xì)菌雙雜交試劑
        3.2.4 常用緩沖液
    3.3 豬鏈球菌2型雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建
        3.3.1 豬鏈球菌2型基因組的提取
        3.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成
        3.3.3 PCR產(chǎn)物的回收
        3.3.4 酶切與連接
        3.3.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備
        3.3.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.3.7 菌落PCR初步篩選和測(cè)序鑒定
        3.3.8 質(zhì)粒的小量制備
    3.4 豬鏈球菌2型(p)ppGpp合成酶與核糖體的相互作用
        3.4.1 細(xì)菌雙雜交自激活實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證
        3.4.2 RelA、RelQ分別與核糖體亞基雙雜交
        3.4.3 RelA中RSD結(jié)構(gòu)域與核糖體亞基雙雜交
    3.5 豬鏈球菌2型(p)ppGpp合成酶缺失突變體的構(gòu)建及表型研究
        3.5.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
        3.5.2 relQ上下游同源臂和氯霉素抗性基因的擴(kuò)增與純化
        3.5.3 PCR產(chǎn)物的酶切、連接與轉(zhuǎn)化
        3.5.4 質(zhì)粒的小量制備
        3.5.5 缺失突變體重組質(zhì)粒的酶切鑒定
        3.5.6 豬鏈球菌2型SC-19和△relA缺失突變株的電轉(zhuǎn)化
        3.5.7 缺失突變菌株的抗性篩選
        3.5.8 缺失突變菌株的PCR鑒定
4 結(jié)果與分析
    4.1 豬鏈球菌2型雙雜交文庫(kù)的構(gòu)建
    4.2 RelA、RelQ與核糖體亞基的相互作用
        4.2.1 RelA、RelQ蛋白結(jié)構(gòu)分析
        4.2.2 細(xì)菌雙雜交自激活實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果
        4.2.3 RelA、RelQ與核糖體的互作結(jié)果
        4.2.4 RelA中RSD結(jié)構(gòu)域與核糖體互作結(jié)果
    4.3 豬鏈球菌2型(p)ppGpp合成酶缺失突變體的構(gòu)建及表型
        4.3.1 自殺性重組質(zhì)粒pSET4s-△relQ的構(gòu)建及酶切鑒定
        4.3.2 豬鏈球菌2型△relQ和△relQ△relA缺失突變株單交換的篩選及PCR鑒定
5 討論
    5.1 細(xì)菌雙雜交方法的優(yōu)勢(shì)與缺點(diǎn)
    5.2 RelA/RelQ與核糖體亞基互作的蛋白
    5.3 RelA、RelQ以及RSD與核糖體互作蛋白的之間關(guān)系
    5.4 突變篩選中存在的問題
結(jié)論與展望
參考文獻(xiàn)
附表
致謝



本文編號(hào)：3893986