產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌(Listeria monocytogenes, LM)為胞內(nèi)寄生菌,可在宿主細(xì)胞漿中繁殖,因此,其減毒菌株可作為活疫苗載體,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。PCR分別擴(kuò)增綠色熒光蛋白EGFP基因、產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌hly基因啟動(dòng)子Phly和actA基因啟動(dòng)子Pact A,將表達(dá)盒Phly-egfp和PactA-egfp分別克隆至單增李斯特菌復(fù)制型質(zhì)粒pKSV7,得重組質(zhì)粒pKSV7-Phly-egfp和pKSV7-PactA-egfp;重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化缺失actA/plcB的產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌LM-1003感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)抗生素抗性篩選和PCR鑒定得候選菌株Lm-PactA-EGFP(LM-1007)、 Lm-Phly-EGFP(LM-1010);熒光顯微鏡觀察證實(shí)候選菌株均表達(dá)EGFP,共聚焦顯微鏡觀察證實(shí)候選菌株在被感染的小鼠巨噬細(xì)胞J774.A1中均表達(dá)EGFP,表明啟動(dòng)子Phly和PactA在體內(nèi)和體外均工作。15只6-8周齡BABL/c(H-2Kd)小鼠平均分為3組,每組每只小鼠分別接種PBS、107CFU LM-1011(pKSV7-Phly電轉(zhuǎn)化...

【文章頁(yè)數(shù)】：71 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的研究進(jìn)展
        1.1 產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌概述
        1.2 產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌致病機(jī)理
    2 產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌作為活疫苗載體的研究概述
        2.1 LM活疫苗載體的基本原理
        2.2 LM活載體疫苗的構(gòu)建
        2.3 減毒LM作為活疫苗載體的優(yōu)勢(shì)
    3 疫苗佐劑
        3.1 鋁鹽類膠體佐劑
        3.2 弗氏佐劑(Freund's adjuvant,FA)
        3.3 CpG
        3.4 ActA作為一種新型免疫佐劑
    4 本研究目的和意義
    參考文獻(xiàn)
第二章 表達(dá)EGFP的重組產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的構(gòu)建及其免疫特性研究
    摘要
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)材料
        1.2 引物設(shè)計(jì)與合成
        1.3 PCR擴(kuò)增
        1.4 pUC19-Phly,pUC19-PactA,pUC19-egfp克隆載體的構(gòu)建及鑒定
        1.5 pKSV7-Phly-egfp,pKSV7-PactA-egfp、pKSV7-Phly載體構(gòu)建及鑒定
        1.6 pKSV7-Phly、pKSV7-Phly-egfp,pKSV7-PactA-egfp電轉(zhuǎn)化至LM-1003
        1.7 細(xì)胞培養(yǎng)
        1.8 激光共聚焦顯微鏡下觀察
        1.9 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)
    2 結(jié)果
        2.1 pKSV7-PactA-egfp,pKSV7-Phly-egfp質(zhì)粒載體的構(gòu)建
        2.2 熒光顯微鏡下觀察LM1007,LM1010
        2.3 在激光共聚焦顯微鏡觀察
        2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
    3 討論
    參考文獻(xiàn)
    ABSTRACT
第三章 產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌的ActA蛋白NH₂結(jié)構(gòu)域(30-264aa)具分子佐劑特性
    摘要
    1 材料和方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.2 綠色熒光蛋白EGFP的大腸桿菌表達(dá)與純化
        1.3 ActA(30-264aa)的大腸桿菌表達(dá)與純化
        1.4 EGFP與ActA蛋白純化后切膠回收
        1.5 動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)
    2 結(jié)果
        2.1 EGFP蛋白的表達(dá)與純化
        2.2 ActA蛋白的表達(dá)與純化
        2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
    3 討論
    參考文獻(xiàn)
    ABSTRACT
全文總結(jié)
致謝
附錄1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
附錄2 培養(yǎng)基和溶液配方



本文編號(hào)：3884677