禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)引起的主要表現(xiàn)為呼吸道、生殖道損傷和免疫力、產(chǎn)蛋率下降等多種臨床癥候群的接觸性傳染病。禽流感病毒是一種負(fù)鏈RNA病毒,屬于正黏病毒科A型流感病毒屬,根據(jù)致病力大小可分為高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)和低致病性禽流感(Low pathogenic avian influenza,LPAI)兩大類。H9亞型禽流感屬于LPAI,但其感染宿主廣泛,感染率較高,往往造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。血凝素(Hemagglutinin,HA)是禽流感病毒最為重要的表面蛋白之一,是重要的保護(hù)性抗原,也是構(gòu)建DNA疫苗的首選基因。本研究以分離鴨源H9亞型毒株的全長(zhǎng)HA基因與真核表達(dá)載體pVAX1構(gòu)建pVAX1-HA DNA疫苗,采用活體電擊方法在小鼠、雞和鴨上進(jìn)行DNA疫苗的免疫效果評(píng)價(jià),并探究DNA疫苗與滅活苗聯(lián)合使用對(duì)免疫效果的影響。1.從鴨樣品中分離出的病毒經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出HA基因片段,并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序及遺傳進(jìn)化分析,結(jié)果顯示該分離毒株為H9亞型禽流感病毒,HA蛋白裂解位...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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摘要
Abstract
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1 前言
    1.1 AIV的基因組和主要結(jié)構(gòu)蛋白功能
    1.2 H9亞型禽流感的流行病學(xué)與危害
    1.3 H9 亞型禽流感DNA疫苗研究
        1.3.1 DNA疫苗的免疫機(jī)理
        1.3.2 DNA疫苗與其優(yōu)點(diǎn)
        1.3.3 禽流感DNA疫苗的研究進(jìn)展
    1.4 研究的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 病料、載體、細(xì)胞和菌種
        2.1.2 血清、滅活疫苗和抗體
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.4 主要試劑
        2.1.5 主要儀器
        2.1.6 主要試劑以及培養(yǎng)基的配制
    2.2 方法
        2.2.1 病毒的分離
        2.2.2 分離毒株血凝價(jià)和血凝抑制價(jià)的測(cè)定
        2.2.3 分離毒株RNA的提取
        2.2.4 分離毒株HA基因的擴(kuò)增
        2.2.5 HA基因的克隆轉(zhuǎn)化與測(cè)序分析
        2.2.6 pVAX1-HA DNA疫苗的構(gòu)建與制備
        2.2.7 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-HA轉(zhuǎn)染與表達(dá)蛋白的鑒定
        2.2.8 pVAX1-HA DNA疫苗對(duì)小鼠的免疫效果評(píng)價(jià)
        2.2.9 DNA疫苗對(duì)SPF雞和鴨的免疫效果評(píng)價(jià)
        2.2.10 DNA疫苗對(duì)鴨的免疫效果評(píng)價(jià)
3 結(jié)果
    3.1 H9 亞型禽流感病毒的分離鑒定與測(cè)序分析
        3.1.1 分離毒株的HA基因擴(kuò)增
        3.1.2 重組質(zhì)粒pMD18-T-HA雙酶切鑒定
        3.1.3 HA基因的測(cè)序與分析
    3.2 DNA疫苗的制備與鑒定
        3.2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-HA雙酶切鑒定
        3.2.2 Western blot鑒定重組質(zhì)粒pVAX1-HA表達(dá)
    3.3 不同免疫組實(shí)驗(yàn)鼠免疫效果的評(píng)價(jià)
        3.3.1 小鼠臨床體征的觀測(cè)
        3.3.2 pVAX1-HA DNA疫苗免疫小鼠后抗體的測(cè)定
        3.3.3 DNA疫苗免疫小鼠后IL-4、IL-6和IFN-γ濃度的測(cè)定
    3.4 DNA疫苗免疫SPF雞和鴨免疫效果的測(cè)定
    3.5 DNA疫苗免疫鴨的抗體測(cè)定
4 討論
    4.1 H9 亞型禽流感病毒的分離鑒定與測(cè)序分析
    4.2 pVAX1-HA DNA疫苗的構(gòu)建及鑒定
    4.3 DNA疫苗對(duì)小鼠的免疫效果
    4.4 pVAX1-HA DNA疫苗對(duì)SPF雞和鴨的免疫效果
    4.5 pVAX1-HA DNA疫苗對(duì)鴨的免疫效果
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文
致謝
附錄1 pVAX1 表達(dá)載體
附錄2 分離株HA基因序列



本文編號(hào)：3882784