水牛因具有易飼養(yǎng)、乳質(zhì)好、抗逆性強等諸多優(yōu)良的生物學特性,被認為最具開發(fā)價值的經(jīng)濟物種之一。但我國本地水牛因發(fā)情不明顯、乏情期長、產(chǎn)后卵巢長時間不活動等因素影響,導致繁殖性能普遍較低,致使我國水牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展嚴重滯后。因此如何提高水牛的繁殖能力,成為推動水牛業(yè)的發(fā)展亟需解決的關鍵問題。研究表明BMP15和GDF9基因在雌性動物的卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,雜合突變的BMP15和GDF9綿羊產(chǎn)羔率顯著高于野生型,臨床醫(yī)學數(shù)據(jù)也表明女性BMP15和GDF9發(fā)生突變也顯著影響受孕率。為此,本研究應用CRISPR/Cas9靶向基因編輯技術突變BMP15和GDF9基因,探討提高水牛繁殖性能的可行性。主要研究結果如下：1.水牛BMP15和GDF9基因的克隆及其在卵泡發(fā)育過程中的表達。通過PCR、 RT-PCR成功克隆得到水牛BMP15基因的全長CDS及全基因組序列,長度分別為1185 bp和6490 bp,序列比對顯示與奶牛相應序列的相似性分別為99%和97%。水牛GDF9的全長CDS為1362bp,與奶牛序列相似性為98%。對水牛BMP15和GDF9蛋白結構通過生物信息學的預測,分析顯示在氨基酸29...

【文章頁數(shù)】：97 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    引言
    1.1 TGF-b超家族對卵泡發(fā)育的影響
        1.1.1 配體
        1.1.2 受體
        1.1.3 TGF-b超家族的信號傳遞
        1.1.4 TGF-b超家族的活性調(diào)節(jié)
        1.1.5 BMP15和GDF9對卵泡發(fā)育的影響
    1.2 基因編輯
        1.2.1 人工核酸酶對基因組的編輯
        1.2.2 CRISPR/Cas9發(fā)展史
        1.2.3 CRISPR/Cas9的功能
        1.2.4 CRISPR/Cas9基因編輯的原理
    1.3 DNA斷裂修復途徑的選擇
        1.3.1 DSB的產(chǎn)生
        1.3.2 DSB的修復途徑
        1.3.3 染色體介導的調(diào)控DSB修復途徑選擇
        1.3.4 53BP1促進NEHJ
        1.3.5 BRCA1抑制53BP1依賴性的NHEJ,促進HR
        1.3.6 細胞周期調(diào)控DSB末端的切割和修復途徑的選擇
        1.3.7 染色體結構調(diào)控DSB修復途徑
        1.3.8 組蛋白抑制劑對DNA修復關鍵蛋白的影響
    1.4 展望
第二章 水牛BMP15和GDF9克隆及卵泡發(fā)生相關基因在卵巢發(fā)育各時期的表達規(guī)律研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實驗材料
    2.2 實驗方法
        2.2.1 引物設計
        2.2.2 基因組和總RNA提取
        2.2.3 PCR、RT-PCR和qPCR
        2.2.4 感受態(tài)制備及轉化
        2.2.5 PCR產(chǎn)物回收、克隆及測序
        2.2.6 蛋白結構的預測
    2.3 實驗結果
        2.3.1 PCR擴增、克隆與測序
        2.3.2 QPCR檢測卵泡不同發(fā)育時期相關基因的表達規(guī)律
        2.3.3 水牛BMP15啟動子的構建和啟動活性的分析
        2.3.4 水牛BMP15和GDF9發(fā)生相關基因生物信息學分析
    2.4 結果分析及討論
    2.5 結論
第三章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除效率的研究
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實驗材料
    3.2 實驗方法
        3.2.1 gRNA設計
        3.2.2 gRNA表達載體及活性驗證載體的構建和檢測
        3.2.3 感受態(tài)制備及轉化
        3.2.4 gRNA活性分析
        3.2.5 統(tǒng)計分析gRNA各位位點堿基分布的概率
    3.3 實驗結果
        3.3.1 gRNA活性分析
        3.3.2 不同gRNA和Cas9摩爾及培養(yǎng)時間對Cas9編輯效率的影響
        3.3.3 活性gRNA各位點不同堿基分布概率統(tǒng)計
    3.4 結果分析及討論
    3.5 結論
第四章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯人源miRNA的研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 實驗材料
    4.2 實驗方法
        4.2.1 gRNA設計
        4.2.2     gRNA表達載體及活性驗證載體的構建和檢測
        4.2.3 gRNA活性分析
        4.2.4 CRISPR/Cas9靶向編輯miRNA-182和miRNA-155的檢測
        4.2.5 miRNA-182和miRNA-155的靶向編輯效率的統(tǒng)計
    4.3 實驗結果
        4.3.1 gRNA活性分析
        4.3.2 CRISPR/Cas9靶向編輯miRNA-182和miRNA-155
        4.3.3 miRNA-182和miRNA-155突變類型及效率的統(tǒng)計
    4.4 結果分析及討論
    4.5 結論
第五章 應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水牛體細胞基因組的研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實驗材料
    5.2 實驗方法
        5.2.1 引物設計
        5.2.2 gRNA表達載體及活性驗證載體的構建和檢測
        5.2.3 感受態(tài)制備及轉化
        5.2.4 gRNA活性分析
        5.2.5 BFF細胞的分離和培養(yǎng)
        5.2.6 BFF細胞凍存與復蘇
        5.2.7 BFF細胞的轉染
        5.2.8 CRISPR/Cas9靶向編輯水牛BMP15和GDF9的檢測
        5.2.9 CRISPR/Cas9靶向編輯水牛BMP15基因脫靶效率的檢測
        5.2.10 CRISPR/Cas9靶向編輯水牛BMP15基因大片段刪除的檢測
        5.2.11 CRISPR/Cas9靶向同時編輯BMP15和GDF9基因的檢測
    5.3 實驗結果
        5.3.1 水牛BMP15和GDF9的gRNA活性分析
        5.3.2 水牛gRNA4-bBMP15和gRNA5-GDF9靶向敲除的檢測
        5.3.3 水牛gRNA5-bBMP15和gRNA4-GDF9靶向敲除的檢測
        5.3.4 水牛BMP15基因大片段的刪除
        5.3.5 CRISPR/Cas9在水牛BFF細胞脫靶效率的分析
    5.4 結果分析及討論
    5.5 結論
第六章 基因斷裂DNA修復機制的選擇的探究
    6.1 材料與方法
        6.1.1 實驗材料
    6.2 試驗方法
        6.2.1 gRNA設計
        6.2.2 293T細胞對不同藥物的毒性分析
        6.2.3 細胞轉染Reportor及相應gRNA表達載體
        6.2.4 轉染后細胞總RNA及蛋白的提取
        6.2.5 細胞周期的分析
    6.3 實驗結果
        6.3.1 293T細胞對不同藥物的毒性分析
        6.3.2 Reportor熒光表達流式分析
        6.3.3 不同藥物聯(lián)合處理處理對DNA修復機制的選擇分析
        6.3.4 TSA處理后對細胞周期的影響
    6.4 結果分析及討論
    6.5 結論
參考文獻
致謝
攻讀碩博期間發(fā)表學術論文



本文編號：3875944