發(fā)布時間：2023-12-09 16:20

　　口蹄疫(foot and mouth disease, F MD)是由口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性的傳染病。FMDV是單鏈正義RNA病毒,屬于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬。病毒基因組的長度約為8500 nt。FMDV可以感染70多種偶蹄目動物,包括豬、牛、羊等家畜。FMD是國際獸疫局規(guī)定的A類傳染病,大規(guī)模爆發(fā)會給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。目前,注射疫苗是控制口蹄疫疫情的重要手段,但病毒具有高度的變異性,導致疫苗有效性大為降低。最近的研究已經(jīng)證實在哺乳動物中RNA干擾(RNAi)可以作為一種抗病毒機制。因此,通過RNAi和轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出表達針對口蹄疫病毒的shRNA的抗病轉(zhuǎn)基因豬新品種,可能成為防控口蹄疫的有效途徑,從而保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。本研究針對口蹄疫病毒基因組保守區(qū)3D聚合酶基因和2B非結(jié)構(gòu)蛋白基因設(shè)計并構(gòu)建了表達shRNA抗病毒干擾載體。轉(zhuǎn)基因細胞具有穩(wěn)定的shRNA表達,并且和對照細胞相比,表達shRNA的轉(zhuǎn)基因細胞具有高效的抗FMDV的能力。在100和1000TCID50劑量的病毒...

【文章頁數(shù)】：122 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞
第一章 引言
    1.1 口蹄疫
        1.1.1 口蹄疫與其流行現(xiàn)狀
        1.1.2 口蹄疫病毒的基因組構(gòu)成
        1.1.3 口蹄疫病毒的結(jié)構(gòu)
        1.1.4 口蹄疫病毒的感染周期
        1.1.5 口蹄疫的發(fā)病機制
        1.1.6 口蹄疫的防控
    1.2 RNA干擾
        1.2.1 RNA干擾的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 RNA干擾的分子機制
        1.2.3 RNA干擾與基因功能分析和基因治療
        1.2.4 RNAi與抗病毒感染
    1.3 RNAi在抗FMDV中的研究
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 材料方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 生物材料
        2.1.2 實驗儀器及耗材
        2.1.3 實驗試劑及溶液配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 感受態(tài)細胞的制備(CaCl₂法)
        2.2.2 感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化
        2.2.3 質(zhì)粒DNA小量制備(OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒)
        2.2.4 酶切產(chǎn)物的膠回收(Qiaquick膠回收試劑盒)
        2.2.5 DNA片段的連接
        2.2.6 去內(nèi)毒素質(zhì)粒的大量提取(OMEGA去內(nèi)毒素大量提取試劑盒)
        2.2.7 組織和細胞基因組提取(使用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit)
        2.2.8 PCR反應條件及體系
        2.2.9 Southern Blotting
        2.2.10 細胞復蘇
        2.2.11 細胞傳代培養(yǎng)
        2.2.12 細胞凍存
        2.2.13 電轉(zhuǎn)制備轉(zhuǎn)基因細胞
        2.2.14 轉(zhuǎn)基因細胞系的篩選
        2.2.15 檢測病毒效價
        2.2.16 檢測攻毒前后轉(zhuǎn)基因細胞shRNA表達水平
        2.2.17 IBRS-2/BHK-21轉(zhuǎn)基因細胞上檢測攻毒后細胞樣品病毒效價的測定
        2.2.18 細胞病變效應(CPE)檢測及細胞內(nèi)病毒復制動力學檢測
        2.2.19 體細胞核移植制備轉(zhuǎn)基因克隆豬
        2.2.20 轉(zhuǎn)基因克隆豬攻毒驗證抗FMDV能力
        2.2.21 血液組織中的病毒量檢測
        2.2.22 抗體檢測
        2.2.23 IFN-γ mRNA的定量分析
        2.2.24 流式細胞技術(shù)分析免疫細胞
    2.3 統(tǒng)計分析
第三章 實驗結(jié)果與分析
    3.1 構(gòu)建口蹄疫病毒特異性shRNA表達載體
    3.2 轉(zhuǎn)基因細胞系的建立及篩選
    3.3 shRNA轉(zhuǎn)基因細胞有穩(wěn)定的siRNAs表達并能顯著地抗抵口蹄疫病毒感染
        3.3.1 檢測攻毒前后細胞shRNA表達水平變化
        3.3.2 攻毒前后病毒滴度(TCID₅₀)水平的變化
        3.3.3 細胞病變效應與病毒復制動力學
    3.4 制備轉(zhuǎn)基因克隆豬并鑒定shRNA的表達
        3.4.1 體細胞核移植制備轉(zhuǎn)基因克隆豬和非轉(zhuǎn)基因克隆豬
        3.4.2 克隆豬的分子檢測
    3.5 shRNA轉(zhuǎn)基因克隆豬抵抗口蹄疫病毒感染效果的攻毒驗證
        3.5.1 預實驗確定病毒SID50

        3.5.2 攻毒實驗分組
        3.5.3 臨床癥狀的分析和體溫變化情況
        3.5.4 血毒癥消長動力學
        3.5.5 屠宰后組織帶毒鑒定
        3.5.6 攻毒后豬的抗體應答分析
        3.5.7 攻毒后豬血液中的IFN-γ的變化分析
        3.5.8 攻毒后豬血液中的免疫細胞的變化分析
        3.5.9 攻毒后豬血液中口蹄疫病毒序列的變化分析
    3.6 小結(jié)
第四章 討論與展望
結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
個人簡歷



本文編號：3871803

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