新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽類的急性高致病性病毒性傳染病,是危害養(yǎng)雞業(yè)最主要的疫病之一。疫苗免疫是世界各主要養(yǎng)禽國家用于預防和控制新城疫流行和發(fā)生的最主要措施,也是最經(jīng)濟最有效的技術手段。目前,商品化的疫苗,無論是滅活疫苗還是活疫苗均具有良好的免疫效果,但其生產(chǎn)基質為雞胚,生產(chǎn)成本高,且雞胚的無害化處理過程會增加一定的生物安全風險和環(huán)保壓力。隨著分子生物學技術的發(fā)展,采用哺乳動物細胞系表達特定蛋白而制備的治療性活性生物物質或基因工程亞單位疫苗已取得了很大的進展,有許多產(chǎn)品已商品化,因此也成為當前獸用疫苗研究的熱點。本研究擬使用293T細胞系表達新城疫主要保護性抗原F蛋白,探索性研制新城疫亞單位疫苗,為新城疫新型疫苗研發(fā)提供一種新的研究路徑。首先,本研究將NDV LaSota株F基因插入到攜帶綠色熒光基因的慢病毒載體pHB中,構建pHB-F轉移載體。利用脂質體將包裝慢病毒的三種質粒pHB-F、pX、pG共同轉染293T細胞,收獲包裝成功的慢病毒,然后再利用包裝的慢病毒感染293T細胞,最...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 引言
    1.1 新城疫
        1.1.1 研究概述
        1.1.2 流行病學
        1.1.3 臨床癥狀
        1.1.4 病理變化
        1.1.5 診斷方法
        1.1.6 防控手段
        1.1.7 ND疫苗研究進展
    1.2 新城疫病毒
        1.2.1 分類和形態(tài)
        1.2.2 生物學特性
        1.2.3 理化特性
        1.2.4 培養(yǎng)特性
        1.2.5 基因組結構
        1.2.6 NP蛋白
        1.2.7 P蛋白
        1.2.8 M蛋白
        1.2.9 F蛋白
        1.2.10 HN蛋白
        1.2.11 L蛋白
    1.3 慢病毒載體系統(tǒng)
        1.3.1 慢病毒載體系統(tǒng)的建立
        1.3.2 慢病毒載體系統(tǒng)的應用
    1.4 目的和意義
第二章 穩(wěn)定表達F蛋白的F-293T細胞系的構建
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 載體、毒株和細胞
        2.2.2 主要試劑
    2.3 儀器設備
    2.4 方法
        2.4.1 新城疫病毒RNA提取
        2.4.2 反轉錄
        2.4.3 T載體的構建
        2.4.4 轉移載體的構建
        2.4.5 包裝質粒、包膜質粒抽提
        2.4.6 293T細胞的培養(yǎng)、傳代及凍存
        2.4.7 細胞轉染
        2.4.8 慢病毒感染
        2.4.9 細胞的篩選和擴大培養(yǎng)
        2.4.10 RT-PCR鑒定
        2.4.11 SDS-PAGE電泳
        2.4.12 Western Blot
    2.5 結果
        2.5.1 pT-F載體的構建
        2.5.2 轉移載體pHB-F的構建
        2.5.3 包裝質粒、包膜質粒的提取
        2.5.4 細胞轉染
        2.5.5 慢病毒感染
        2.5.6 陽性細胞克隆
        2.5.7 細胞穩(wěn)定性檢測
        2.5.8 SDS-PAGE
        2.5.9 Western Blot鑒定
    2.6 討論與小結
        2.6.1 病毒感染的影響因素
        2.6.2 影響蛋白表達量的因素
        2.6.3 F蛋白反應原性檢測
第三章 F蛋白免疫原性的檢測
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 SPF雞(胚)、毒株、血清和細胞
        3.2.2 主要試劑
    3.3 儀器設備
    3.4 方法
        3.4.1 蛋白提取
        3.4.2 免疫接種
        3.4.3 1%雞紅細胞懸液的配置
        3.4.4 NDV EID50的測定
        3.4.5 中和試驗
    3.5 結果
        3.5.1 F蛋白檢測
        3.5.2 LaSota株EID50的測定
        3.5.3 雞胚中和試驗
    3.6 討論與小結
        3.6.1 細胞上清中F蛋白的濃縮和純化
        3.6.2 F蛋白免疫活性檢測
第四章 結論
第五章 創(chuàng)新點
參考文獻
附錄 溶液及配制方法
致謝
作者簡歷



本文編號：3862202