為了能表達(dá)出具有良好免疫原性的牛皰疹病毒Ⅰ型(BoHV-1)gD蛋白,為進(jìn)一步建立BoHV-1檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ),試驗(yàn)將BoHV-1 gD蛋白的基因片段通過(guò)PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化的方法連接到pGEX-6P-1載體上,經(jīng)過(guò)單雙酶切鑒定、PCR鑒定后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與NCBI上公布的BoHV-1 gD蛋白的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比,并通過(guò)SDS-PAGE、Western-blot以及ELISA檢測(cè)方法對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)情況、抗原性進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明:gD基因成功插入pMD18-T載體中,將測(cè)序結(jié)果與已經(jīng)發(fā)表在NCBI上的BoHV-1 gD蛋白基因比對(duì),相似性為98%,共有19個(gè)堿基發(fā)生突變,并無(wú)堿基插入或缺失。通過(guò)軟件翻譯與原始氨基酸序列(AFB76672.1)進(jìn)行比對(duì),共有8個(gè)氨基酸發(fā)生突變。將gD基因插入pGEX-6p-1載體中,命名為pGEX-6p-gD質(zhì)粒,構(gòu)建的pGEX-6P-gD/BL21(DE3)重組菌表達(dá)出的蛋白質(zhì)與目的蛋白質(zhì)大小一致,且該蛋白質(zhì)免疫后小鼠血清特異性識(shí)別BoHV-1。說(shuō)明本試驗(yàn)成功表達(dá)出具有部分免疫原性的BoHV-1重組gD蛋白。

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【文章目錄】：
1 材料
    1.1 菌株、病毒、細(xì)胞
    1.2 試驗(yàn)動(dòng)物
    1.3 主要試劑
2 方法
    2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成
    2.2 基因組DNA模板的提取
    2.3 目的基因US6的擴(kuò)增
    2.4 T載體的連接及測(cè)序分析
    2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
    2.6 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
    2.7 重組蛋白 Western-blot分析
    2.8 重組蛋白的抗原性鑒定
3 結(jié)果與分析
    3.1 BoHV-1 gD基因的PCR擴(kuò)增
    3.2 T載體的連接及測(cè)序鑒定
    3.3 重組菌株的構(gòu)建及鑒定
    3.4 gD蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及Western-blot鑒定
    3.5 重組蛋白的抗原性鑒定
4 討論



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