固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins, SREBPs)屬于核轉(zhuǎn)錄因子家族,激活膽固醇和脂類合成與轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因,對維持體內(nèi)的脂類平衡至關(guān)重要。迄今為止,對于奶牛乳腺上皮細(xì)胞中SREBPs或其他核轉(zhuǎn)錄因子如PPARy (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma)哪個(gè)才是最重要的調(diào)節(jié)子仍有爭論。mTOR (the mammalian target of rapamycin)是蛋白合成和細(xì)胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子,最近研究表明mTORC1能夠調(diào)節(jié)SREBP1促進(jìn)脂類合成。然而,SREBP1對mTOR在乳脂合成中的影響至今沒有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在確定奶牛乳腺上皮細(xì)胞SREBP1在乳脂合成中的作用及SREBP1對mTOR表達(dá)影響。通過研究SREBP1基因過表達(dá)和基因沉寂對乳脂合成影響實(shí)驗(yàn),鑒定SREBP1在乳脂合成中的功能。實(shí)驗(yàn)通過添加硬脂酸和血清檢測對SREBP1表達(dá)影響及對乳脂合成影響,確定硬脂酸和血清是否通過調(diào)節(jié)SREBP1從而調(diào)節(jié)乳脂合成,進(jìn)一步闡明SREBP1對乳脂合...

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
1 前言
    1.1 乳腺泌乳及乳脂合成機(jī)理
        1.1.1 乳腺泌乳過程及調(diào)節(jié)機(jī)制
        1.1.2 乳的生物化學(xué)組成
        1.1.3 乳脂合成機(jī)理及調(diào)控
    1.2 乳脂合成相關(guān)信號通路
        1.2.1 SREBPs研究進(jìn)展
        1.2.2 PPARs研究進(jìn)展
        1.2.3 JAK-Stat5信號通路
        1.2.4 mTOR途徑
    1.3 乳脂合成關(guān)鍵基因的研究進(jìn)展
    1.4 本研究的目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
        2.2.2 SREBP1基因沉寂分析
        2.2.3 SREBP1過表達(dá)分析
        2.2.4 硬脂酸及血清對乳脂合成影響
    2.3 數(shù)據(jù)分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
    3.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞SREBP1基因沉寂分析
        3.2.1 最佳抑制效果siRNA的篩選
        3.2.2 SREBP1基因沉寂效率
        3.2.3 SREBP1基因沉寂對乳脂合成相關(guān)基因的影響
        3.2.4 SREBP1基因沉寂對乳腺上皮細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響
        3.2.5 IF檢測SREBP1與p-mTOR的表達(dá)與定位
        3.2.6 乳腺上皮細(xì)胞脂滴含量測定
        3.2.7 乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯含量測定
    3.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞SREBP1過表達(dá)分析
        3.3.1 SREBP1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.2 重組質(zhì)粒pMD18-T-SREBP1的構(gòu)建及PCR驗(yàn)證
        3.3.3 重組質(zhì)粒pGCMV/IRES/EGFP/SREBP1的構(gòu)建及PCR驗(yàn)證
        3.3.4 質(zhì)粒pGCMV/IRES/EGFP/SREBP1轉(zhuǎn)染至奶牛乳腺上皮細(xì)胞
        3.3.5 SREBP1過表達(dá)對乳脂合成相關(guān)基因的影響
        3.3.6 SREBP1過表達(dá)對乳腺上皮細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響
        3.3.7 IF法檢測SREBP1與p-mTOR表達(dá)與定位
        3.3.8 乳腺上皮細(xì)胞脂滴含量測定
        3.3.9 乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯含量測定
    3.4 硬脂酸及血清對奶牛乳腺上皮細(xì)胞SREBP1與mTOR合成影響
        3.4.1 硬脂酸及血清對乳脂合成相關(guān)基因的影響
        3.4.2 硬脂酸及血清對乳腺上皮細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響
        3.4.3 IF法檢測SREBP1與p-mTOR表達(dá)與定位
        3.4.4 乳腺上皮細(xì)胞脂滴含量測定
        3.4.5 乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯含量測定
4 討論
    4.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞模型的建立
    4.2 SREBP1的不同修飾及加工形式與功能的關(guān)系
    4.3 SREBP1基因沉寂對奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成影響
    4.4 SREBP1基因過表達(dá)對奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成影響
    4.5 奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成模型的建立
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號：3845385