碳酸酐酶4(Carbonic Anhydrase 4,CA4)是碳酸酐酶家族成員之一,催化二氧化碳與水反應(yīng)生成碳酸氫根與氫離子的可逆反應(yīng),主要影響細(xì)胞環(huán)境中的pH值。目前,基于CA4的研究主要集中在肺、骨骼肌和癌癥中,對生殖發(fā)育方面的研究較少。研究表明,CA4在雞貯精腺上皮細(xì)胞中有表達(dá),并且在子宮陰道交接部表達(dá)量高,提示CA4對雌性家禽貯精腺酸堿環(huán)境具有調(diào)控作用。本研究以雞胚成纖維細(xì)胞(DF-1)為模型,利用RNAi方法,通過細(xì)胞培養(yǎng)、免疫熒光、免疫組化、qRT-PCR等技術(shù)研究CA4對DF-1細(xì)胞培養(yǎng)液pH和左旋乳酸的作用。主要研究結(jié)果如下:(1)篩查雞CA4基因外顯子區(qū)段上存在的SNP位點,發(fā)現(xiàn)6個SNP位點,其中有4個SNP的密碼子變化引起了氨基酸的變化。第620位堿基發(fā)生C/T突變,該位點突變引起脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?第721位堿基發(fā)生T/A突變,該位點突變使色氨酸突變?yōu)榫彼?第796位堿基發(fā)生A/T突變,該位點突變導(dǎo)致編碼的賴氨酸突變?yōu)榻K止密碼子,第847位堿基發(fā)生G/T突變,該位點突變導(dǎo)致編碼的甘氨酸突變?yōu)榘腚装彼帷?2)CA4和MCT4基因均在DF-1細(xì)胞表達(dá),定位于細(xì)胞...

【文章頁數(shù)】：49 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文縮略詞表(ABBREVIATIONS)
1 前言
    1.1 家禽貯精腺研究進(jìn)展
        1.1.1 家禽貯精腺組織結(jié)構(gòu)
        1.1.2 家禽貯精腺分泌物以及其作用
    1.2 CA4基因研究進(jìn)展
        1.2.1 CA4基因和蛋白結(jié)構(gòu)
        1.2.2 CA4基因的表達(dá)與定位
        1.2.3 CA4與精子活力
        1.2.4 CA4與家禽貯精能力有關(guān)
        1.2.5 CA4與單羧酸轉(zhuǎn)運體的協(xié)同作用
    1.3 MCT4基因研究進(jìn)展
        1.3.1 MCT4基因和蛋白結(jié)構(gòu)
        1.3.2 MCT4基因的表達(dá)與功能
    1.4 實驗的目的和意義
2 實驗材料
    2.1 實驗細(xì)胞與DNA
    2.2 抗體
    2.3 實驗儀器
    2.4 實驗試劑與耗材
    2.5 實驗試劑的配制
3 實驗方法
    3.1 雞CA4基因的序列分析
        3.1.1 雞CA4基因的PCR擴增
        3.1.2 CA4基因PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測
    3.2 設(shè)計并合成siRNA
    3.3 DF-1細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        3.3.2 細(xì)胞傳代
        3.3.3 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇
    3.4 雞DF-1細(xì)胞CA4基因mRNA表達(dá)的檢測
        3.4.1 DF-1細(xì)胞RNA提取
        3.4.2 cDNA鏈反轉(zhuǎn)錄合成
        3.4.3 熒光引物設(shè)計
        3.4.4 qRT-PCR
    3.5 DF-1細(xì)胞CA4蛋白表達(dá)的檢測
        3.5.1 CA4的細(xì)胞免疫化學(xué)
        3.5.2 CA4細(xì)胞免疫熒光
        3.5.3 DF-1細(xì)胞內(nèi)CA4的表達(dá)
    3.6 DF-1細(xì)胞中MCT4基因mRNA表達(dá)的檢測
        3.6.1 DF-1細(xì)胞RNA提取
        3.6.2 cDNA鏈反轉(zhuǎn)錄合成
        3.6.3 熒光引物設(shè)計
        3.6.4 qRT-PCR
    3.7 DF-1細(xì)胞上MCT4蛋白表達(dá)的檢測
    3.8 siRNA的轉(zhuǎn)染
    3.9 培養(yǎng)液pH值檢測
    3.10 左旋乳酸含量檢測
    3.11 數(shù)據(jù)分析
4 實驗結(jié)果
    4.1 雞CA4基因序列分析
        4.1.1 CA4基因PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測
        4.1.2 CA4基因測序結(jié)果
    4.2 CA4基因在DF-1細(xì)胞中的表達(dá)
        4.2.1 DF-1細(xì)胞CA4蛋白的表達(dá)
        4.2.2 DF-1細(xì)胞CA4基因mRNA的表達(dá)
    4.3 RNAi干擾DF-1細(xì)胞對CA4表達(dá)的影響
        4.3.1 RNAi對DF-1細(xì)胞CA4mRNA水平的影響
        4.3.2 RNAi對DF-1細(xì)胞CA4蛋白水平的影響
        4.3.3 RNAi對DF-1細(xì)胞培養(yǎng)液CA4蛋白水平的影響
    4.4 MCT4在DF-1細(xì)胞上的表達(dá)
        4.4.1 DF-1細(xì)胞MCT4蛋白的表達(dá)
        4.4.2 DF-1細(xì)胞MCT4基因mRNA的表達(dá)
        4.4.3 CA4基因干擾對DF-1細(xì)胞MCT4基因表達(dá)的影響
        4.4.4 CA4基因干擾對DF-1細(xì)胞MCT4蛋白水平的影響
    4.5 CA4基因干擾對DF-1細(xì)胞培養(yǎng)液pH值的影響
    4.6 CA4基因干擾對DF-1細(xì)胞培養(yǎng)液左旋乳酸含量的影響
5 討論
    5.1 雞CA4基因序列分析
    5.2 CA4在DF-1細(xì)胞上的表達(dá)
    5.3 CA4基因干擾與DF-1細(xì)胞培養(yǎng)液的pH值
    5.4 MCT4基因在DF-1細(xì)胞上表達(dá)
    5.5 雞CA4基因影響DF-1細(xì)胞培養(yǎng)液中左旋乳酸的含量
    5.6 雞CA4可能有利于禽類貯精腺的精子貯存
6 全文結(jié)論
7 進(jìn)一步研究的建議
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號：3844210