牛皰疹病毒Ⅰ型(BHV-1)可引發(fā)牛傳染性鼻氣管炎,對養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。近年來,國內(nèi)外均開展了牛鼻氣管炎疫苗的研制。對于傳統(tǒng)疫苗,滅活苗不能或很少引起細胞免疫而弱毒苗具有毒性和抗藥性;對于新型疫苗,亞單位苗不能在體內(nèi)復制,大多DNA疫苗也只能引起部分的體液免疫,然而,基因缺失疫苗具有免疫標識,利用缺失的基因可以進行野生型感染和疫苗免疫的診斷,已成為新型疫苗研究開發(fā)的主流。為了更高效地構(gòu)建基因缺失疫苗,本研究應用CRISPR/Cas9基因編輯與同源重組技術(shù),構(gòu)建帶有增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)標記并缺失糖蛋白E基因(glycoprotein E,gE)的重組BHV-1病毒,命名為BHV-1 gE^-/EGFP⁺。隨后通過特異性的小向?qū)NA(small guide RNA,sgRNA)敲除BHV-1 gE^-/EGFP⁺病毒基因組中的EGFP基因,該gE基因缺失株命名為BHV-1ΔgE。利用脂質(zhì)體法將pCas9-mCherry質(zhì)...

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略詞表
第一章 牛鼻氣管炎疫苗的研究進展
    1 牛鼻氣管炎概況
        1.1 牛鼻氣管炎病毒基因組結(jié)構(gòu)和典型蛋白功能
        1.2 牛鼻氣管炎病毒的分型
        1.3 牛鼻氣管炎的致病機理
            1.3.1 牛鼻氣管炎的侵染過程
            1.3.2 牛鼻氣管炎的潛伏感染
        1.4 牛鼻氣管炎的流行現(xiàn)狀
    2 牛鼻氣管炎的診斷與防控
        2.1 牛鼻氣管炎的診斷
            2.1.1 病原學方面的檢測手段
                2.1.1.1 包涵體染色鏡檢檢查
                2.1.1.2 BHV-1病毒的分離與鑒定
                2.1.1.3 分子技術(shù)診斷BHV-1
            2.1.2 血清學檢測
                2.1.2.1 中和試驗檢測
                2.1.2.2 間接血凝試驗檢測
                2.1.2.3 瓊脂擴散試驗檢測
                2.1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測
        2.2 牛鼻氣管炎的防控
        2.3 牛鼻氣管炎疫苗的種類
            2.3.1 常規(guī)疫苗
                2.3.1.1 弱毒疫苗
                2.3.1.2 滅活疫苗
            2.3.2 新型疫苗
                2.3.2.1 亞單位疫苗
                2.3.2.2 DNA疫苗
                2.3.2.3 基因工程疫苗
    3 牛鼻氣管炎基因工程疫苗的研制方法
        3.1 同源重組技術(shù)
        3.2 鋅指核酸酶技術(shù)
        3.3 轉(zhuǎn)錄激活樣效應物核酸酶技術(shù)
        3.4 Cre/LoxP系統(tǒng)
        3.5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)
    4 結(jié)語
第二章 基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建BHV-1 gE缺失株及其生物學特性初步鑒定
    前言
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 試劑耗材與實驗儀器
                1.1.1.1 試劑
                1.1.1.2 耗材
                1.1.1.3 儀器
            1.1.2 細胞與病毒
        1.2 方法
            1.2.1 擴增gE基因并測序分析
            1.2.2 敲除載體的構(gòu)建
            1.2.3 供體質(zhì)粒的構(gòu)建
            1.2.4 病毒PCR產(chǎn)物的回收純化
            1.2.5 質(zhì)粒DNA的提取
            1.2.6 細胞凍存與復蘇
            1.2.7 篩選轉(zhuǎn)染效率較高的細胞系
            1.2.8 不同細胞中毒價的測定
            1.2.9 熒光毒株與缺失毒株的拯救
            1.2.10 重組病毒的篩選與鑒定
            1.2.11 重組病毒的純化與擴增
            1.2.12 病毒基因組DNA的提取
            1.2.13 病毒的生物學特性分析
                1.2.13.1 病毒效價的測定
                1.2.13.2 繪制病毒增殖曲線
            1.2.14 數(shù)據(jù)分析標準
    2 實驗結(jié)果
        2.1 實驗設(shè)計
        2.2 BHV-1 gE基因的流行性分析
        2.3 載體的構(gòu)建與鑒定
            2.3.1 敲除載體的構(gòu)建與鑒定
            2.3.2 供體質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        2.4 編輯BHV-1細胞系的篩選
            2.4.1 轉(zhuǎn)染效率篩選
            2.4.2 病毒復制能力篩選
        2.5 重組病毒的篩選與純化
            2.5.1 重組病毒的篩選與鑒定
            2.5.2 重組病毒的噬斑克隆純化
        2.6 親本毒與目的毒株生物學特性比較
            2.6.1 噬斑形成單位的測定與比較
            2.6.2 增殖曲線的繪制
    3 討論
        3.1 細胞系的選擇
        3.2 sgRNA的篩選
        3.3 重組病毒的篩選和外源蛋白的表達
    4 結(jié)論
參考文獻
致謝
個人簡歷及碩士期間成果



本文編號：3838335