本研究采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導的RNAi技術(shù)靶向抑制性別決定相關(guān)基因Zfy的表達，研究Zfy基因在生精過程中的相關(guān)功能及小鼠后代性別比例的變化。通過構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體Retrovirus/Zfy-shRNA和質(zhì)粒載體Psilencer/Zfy-shRNA，用構(gòu)建好的病毒載體和質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染小鼠生精細胞，應用qRT-PCR檢測各組細胞中Zfy基因的mRNA表達水平,驗證干擾載體對Zfy基因的沉默效應。大量包裝生產(chǎn)病毒顆粒和制備質(zhì)粒載體并對公鼠進行睪丸打點注射，每隔7d注射1次，連續(xù)注射4次，最后一次注射14d后，部分雄鼠宰殺采集睪丸組織，qRT-PCR檢測Zfy基因的表達水平；另一部分雄鼠與每組超排處理的雌鼠按1:1合籠，間隔5d合籠1批雌鼠，共合籠3批，觀察后代的性別比例。 結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄病毒Retrovirus/Zfy-shRNA和質(zhì)粒載體Psilencer/Zfy-shRNA轉(zhuǎn)染小鼠生精細胞后，Zfy基因mRNA表達水平都極顯著低于空載體對照組和空白對照組（P<0.01），兩對照組之間無差異顯著性（P>0.05）；睪丸注射逆轉(zhuǎn)錄病毒Retrovirus/Zfy-shRNA...

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
論文中常用縮寫詞英漢對照表
引言
第一篇 研究綜述
    1 性別決定基因研究進展
        1.1 Zfy基因
        1.2 Sry基因
        1.3 Sox-9基因
        1.4 Gata-4基因
        1.5 Sf-1基因
        1.6 Wt-1基因
        1.7 總結(jié)和展望
    2 病毒載體介導RNA干擾的研究進展
        2.1 病毒載體系統(tǒng)簡介
        2.2 穩(wěn)定RNA干擾載體
        2.3 高效RNA干擾載體
        2.4 誘導RNA干擾載體
        2.5 標記RNA干擾載體
        2.6 目的細胞特異性RNA干擾載體
        2.7 問題與展望
    3 RNAi作用機制及RNAi技術(shù)在動物繁殖中的應用
        3.1 RNAi作用機制
        3.2 RNAi技術(shù)在動物繁殖中的應用
        3.3 展望
第二篇 實驗研究
    實驗一：小鼠Zfy基因RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建
        1. 實驗材料
            1.1 主要試劑
            1.2 主要儀器
            1.3 載體、菌株及細胞
        2. 實驗方法
            2.1 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建
            2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝與病毒滴度測定
        3. 實驗結(jié)果
            3.1 shRNA表達序列的設計與合成
            3.2 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的測序鑒定
            3.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝及滴度測定
        4. 討論
    實驗二：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導的RNAi體外調(diào)控Zfy基因表達的實驗研究
        1. 實驗材料
            1.1 主要試劑
            1.2 主要儀器
            1.3 實驗動物
        2. 實驗方法
            2.1 Zfy基因RNA干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及病毒包裝
            2.2 重組RNAi質(zhì)粒載體Psilencer/Zfy-shRNA的大量制備與純化
            2.3 小鼠生精細胞的分離培養(yǎng)
            2.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠生精細胞及質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染小鼠生精細胞
            2.5 熒光實時定量PCR測定生精細胞中Zfy基因mRNA的表達水平
        3. 實驗結(jié)果
            3.1 小鼠生精細胞分離培養(yǎng)的形態(tài)學特征
            3.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對小鼠生精細胞的感染效果
            3.3 生精細胞中Zfy基因mRNA的表達水平
        4. 討論
    實驗三：調(diào)控Zfy基因表達對小鼠后代性別影響的實驗研究
        1. 實驗材料
            1.1 主要試劑
            1.2 主要儀器
            1.3 實驗動物
        2. 實驗方法
            2.1 Zfy基因RNA干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及病毒包裝
            2.2 重組RNAi質(zhì)粒載體Psilencer/Zfy-shRNA的大量制備與純化
            2.3 小鼠體內(nèi)RNA干擾實驗
            2.4 熒光實時定量PCR測定睪丸組織中Zfy基因mRNA的表達水平
            2.5 受孕雌鼠的飼養(yǎng)和后代小鼠的性別鑒定
        3. 實驗結(jié)果
            3.1 PCR產(chǎn)物擴增結(jié)果
            3.2 睪丸組織中Zfy基因mRNA的表達水平
            3.3 小鼠后代性別比例
            3.4 病毒載體和質(zhì)粒載體在小鼠體內(nèi)作用時間
        4. 討論
全文小結(jié)
創(chuàng)新點
參考文獻
致謝
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