本研究采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)靶向抑制性別決定相關(guān)基因Zfy的表達(dá)，研究Zfy基因在生精過(guò)程中的相關(guān)功能及小鼠后代性別比例的變化。通過(guò)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體Retrovirus/Zfy-shRNA和質(zhì)粒載體Psilencer/Zfy-shRNA，用構(gòu)建好的病毒載體和質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染小鼠生精細(xì)胞，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中Zfy基因的mRNA表達(dá)水平,驗(yàn)證干擾載體對(duì)Zfy基因的沉默效應(yīng)。大量包裝生產(chǎn)病毒顆粒和制備質(zhì)粒載體并對(duì)公鼠進(jìn)行睪丸打點(diǎn)注射，每隔7d注射1次，連續(xù)注射4次，最后一次注射14d后，部分雄鼠宰殺采集睪丸組織，qRT-PCR檢測(cè)Zfy基因的表達(dá)水平；另一部分雄鼠與每組超排處理的雌鼠按1:1合籠，間隔5d合籠1批雌鼠，共合籠3批，觀察后代的性別比例。 結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄病毒Retrovirus/Zfy-shRNA和質(zhì)粒載體Psilencer/Zfy-shRNA轉(zhuǎn)染小鼠生精細(xì)胞后，Zfy基因mRNA表達(dá)水平都極顯著低于空載體對(duì)照組和空白對(duì)照組（P<0.01），兩對(duì)照組之間無(wú)差異顯著性（P>0.05）；睪丸注射逆轉(zhuǎn)錄病毒Retrovirus/Zfy-shRNA...

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
論文中常用縮寫(xiě)詞英漢對(duì)照表
引言
第一篇 研究綜述
    1 性別決定基因研究進(jìn)展
        1.1 Zfy基因
        1.2 Sry基因
        1.3 Sox-9基因
        1.4 Gata-4基因
        1.5 Sf-1基因
        1.6 Wt-1基因
        1.7 總結(jié)和展望
    2 病毒載體介導(dǎo)RNA干擾的研究進(jìn)展
        2.1 病毒載體系統(tǒng)簡(jiǎn)介
        2.2 穩(wěn)定RNA干擾載體
        2.3 高效RNA干擾載體
        2.4 誘導(dǎo)RNA干擾載體
        2.5 標(biāo)記RNA干擾載體
        2.6 目的細(xì)胞特異性RNA干擾載體
        2.7 問(wèn)題與展望
    3 RNAi作用機(jī)制及RNAi技術(shù)在動(dòng)物繁殖中的應(yīng)用
        3.1 RNAi作用機(jī)制
        3.2 RNAi技術(shù)在動(dòng)物繁殖中的應(yīng)用
        3.3 展望
第二篇 實(shí)驗(yàn)研究
    實(shí)驗(yàn)一：小鼠Zfy基因RNAi逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建
        1. 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 主要試劑
            1.2 主要儀器
            1.3 載體、菌株及細(xì)胞
        2. 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建
            2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝與病毒滴度測(cè)定
        3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.1 shRNA表達(dá)序列的設(shè)計(jì)與合成
            3.2 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的測(cè)序鑒定
            3.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝及滴度測(cè)定
        4. 討論
    實(shí)驗(yàn)二：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的RNAi體外調(diào)控Zfy基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究
        1. 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 主要試劑
            1.2 主要儀器
            1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2. 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 Zfy基因RNA干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及病毒包裝
            2.2 重組RNAi質(zhì)粒載體Psilencer/Zfy-shRNA的大量制備與純化
            2.3 小鼠生精細(xì)胞的分離培養(yǎng)
            2.4 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染小鼠生精細(xì)胞及質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染小鼠生精細(xì)胞
            2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定生精細(xì)胞中Zfy基因mRNA的表達(dá)水平
        3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.1 小鼠生精細(xì)胞分離培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)特征
            3.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)小鼠生精細(xì)胞的感染效果
            3.3 生精細(xì)胞中Zfy基因mRNA的表達(dá)水平
        4. 討論
    實(shí)驗(yàn)三：調(diào)控Zfy基因表達(dá)對(duì)小鼠后代性別影響的實(shí)驗(yàn)研究
        1. 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 主要試劑
            1.2 主要儀器
            1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2. 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 Zfy基因RNA干擾逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及病毒包裝
            2.2 重組RNAi質(zhì)粒載體Psilencer/Zfy-shRNA的大量制備與純化
            2.3 小鼠體內(nèi)RNA干擾實(shí)驗(yàn)
            2.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定睪丸組織中Zfy基因mRNA的表達(dá)水平
            2.5 受孕雌鼠的飼養(yǎng)和后代小鼠的性別鑒定
        3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            3.1 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果
            3.2 睪丸組織中Zfy基因mRNA的表達(dá)水平
            3.3 小鼠后代性別比例
            3.4 病毒載體和質(zhì)粒載體在小鼠體內(nèi)作用時(shí)間
        4. 討論
全文小結(jié)
創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
導(dǎo)師評(píng)閱表



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