發(fā)布時(shí)間：2023-06-17 21:56

　　通過(guò)向體細(xì)胞中導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子可以將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)。已經(jīng)有很多物種成功地產(chǎn)生相應(yīng)的iPSCs,但是在有蹄類家畜中,尤其是山羊,iPSCs建系成功的卻很少。本研究主要目的是通過(guò)慢病毒攜帶人源的四個(gè)多能基因hOCT4,hSOX2,hKLF4和hcMYC-導(dǎo)入山羊體細(xì)胞,通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)體系和培養(yǎng)體系的優(yōu)化,成功將山羊體細(xì)胞重編程為iPSCs(giPSCs),在此基礎(chǔ)上,使用同樣的方法將克隆奶山羊體細(xì)胞重編程為iPSCs(tgiPSCs),并且將tgiPSCs作為供體細(xì)胞通過(guò)核移植技術(shù),檢測(cè)其能否在體外生產(chǎn)克隆胚胎。本文主要研究結(jié)果如下： 1.摸索出適合山羊iPSCs的誘導(dǎo)體系和培養(yǎng)體系 本試驗(yàn)在前人研究成果的基礎(chǔ)上,首先使用干細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)體系"KNOCKOUT-DMEM+KSR"分別添加人源白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),人源Beta-成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Beta-fibroblast growth factor,(3-FGF),以及兩者都加。試驗(yàn)結(jié)果...

【文章頁(yè)數(shù)】：116 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
目錄
摘要
ABSTRACT
縮略語(yǔ)中英文對(duì)照
前言
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 體細(xì)胞重編程的方法及作用機(jī)制
        1 引言
        2 體細(xì)胞通過(guò)核移植進(jìn)行重編程
        3 體細(xì)胞與干細(xì)胞融合進(jìn)行重編程
        4 細(xì)胞通過(guò)體外培養(yǎng)自發(fā)重編程
        5 轉(zhuǎn)染特異性轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行重編程
    第二章 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞研究進(jìn)展
        1 引言
        2 iPSCs的重編程方法
        3 不同來(lái)源的供體細(xì)胞對(duì)重編程效果的影響
        4 重編程的機(jī)制
        5 iPSCs的篩選方式
        6 外源多能因子的作用
            6.1 OCT4的作用
            6.2 SOX2的作用
            6.3 cMYC的作用
            6.4 KLF4的作用
            6.5 NANOG的作用
            6.6 LIN28的作用
        7 iPSCs的應(yīng)用價(jià)值
            7.1 消除阻礙干細(xì)胞研究的倫理問(wèn)題
            7.2 克服ESCs應(yīng)用中存在的免疫排斥反應(yīng)
            7.3 已經(jīng)取得的研究成果
        8 iPSCs存在的問(wèn)題
            8.1 具有一定的致癌性
            8.2 重編程的效率低
            8.3 以病毒為載體的安全性問(wèn)題
            8.4 來(lái)源于多能干細(xì)胞的組織在移植后存活率低
    第三章 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞與畜牧業(yè)生產(chǎn)
        1 引言
        2 ESCs與畜牧業(yè)生產(chǎn)
            2.1 生產(chǎn)克隆動(dòng)物
            2.2 生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
        3 偶蹄類家畜iPSCs研究進(jìn)展
            3.1 豬iPSCs研究現(xiàn)狀
            3.2 牛iPSCs研究現(xiàn)狀
            3.3 羊iPSCs研究現(xiàn)狀
第二部分 試驗(yàn)部分
    第四章 山羊iPSCs誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系的建立
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 試驗(yàn)動(dòng)物
            2.2 細(xì)胞株
            2.3 試劑耗材及溶液配制
            2.4 試驗(yàn)儀器
            2.5 試驗(yàn)方法
        3 試驗(yàn)結(jié)果
            3.1 羊耳成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察
            3.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析
            3.3 細(xì)胞核型分析
            3.4 質(zhì)粒質(zhì)量檢測(cè)
            3.5 病毒質(zhì)量檢測(cè)
            3.6 山羊iPSCs培養(yǎng)條件
            3.7 山羊iPSCs誘導(dǎo)和培養(yǎng)
        4 討論
            4.1 體細(xì)胞的原代培養(yǎng)與生物學(xué)特性分析
            4.2 山羊iPSCs誘導(dǎo)體系的優(yōu)化
            4.3 山羊iPSCs培養(yǎng)體系的優(yōu)化
            4.4 克隆的挑取和擴(kuò)增
            4.5 山羊iPSCs形態(tài)學(xué)特征
    第五章 山羊iPSCs的鑒定
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 細(xì)胞株
            2.2 試劑耗材及溶液配制
            2.3 試驗(yàn)儀器
            2.4 試驗(yàn)方法
        3 試驗(yàn)結(jié)果
            3.1 細(xì)胞核型
            3.2 堿性磷酸酶檢測(cè)
            3.3 山羊iPSCs多能基因表達(dá)分析
            3.4 山羊iPSCs多能性相關(guān)蛋白表達(dá)分析
            3.5 山羊iPSCs在體外形成類胚體
            3.6 山羊iPSCs在體內(nèi)形成畸胎瘤
        4 討論
            4.1 山羊iPSCs形態(tài)學(xué)分析
            4.2 山羊iPSCs多能性相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)
            4.3 山羊iPSCs的在體內(nèi)和體外的分化潛能鑒定
            4.4 山羊iPSCs核型的鑒定
    第六章 克隆羊和轉(zhuǎn)基因克隆羊iPSCs誘導(dǎo)和鑒定
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 試驗(yàn)動(dòng)物
            2.2 細(xì)胞株
            2.3 試劑耗材及溶液配制
            2.4 試驗(yàn)儀器
            2.5 試驗(yàn)方法
        3 試驗(yàn)結(jié)果
            3.1 不同來(lái)源克隆奶山羊耳成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析
            3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)基因鑒定
            3.3 山羊iPSCs形態(tài)學(xué)分析
            3.4 細(xì)胞核型分析
            3.5 堿性磷酸酶檢測(cè)
            3.6 山羊iPSCs多能蛋白表達(dá)
            3.7 山羊iPSCs在體外形成類胚體
            3.8 TgiPSCs在體內(nèi)形成畸胎瘤
        4 討論
            4.1 TgiPSCs誘導(dǎo)和鑒定
            4.2 TgiPSCs核型分析
    第七章 GiPSCs,克隆山羊iPSCs和tgiPSCs誘導(dǎo)差異
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 細(xì)胞株
            2.2 試劑耗材及溶液配制
            2.3 試驗(yàn)儀器
            2.4 試驗(yàn)方法
        3 試驗(yàn)結(jié)果
            3.1 不同來(lái)源山羊耳成纖維細(xì)胞和病毒感染后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析
            3.2 不同來(lái)源山羊耳成纖維細(xì)胞重編程產(chǎn)生克隆效率和克隆質(zhì)量的差異
            3.3 不同山羊iPSCs內(nèi)源多能基因表達(dá)差異
        4 討論
            4.1 TgiPSCs重編程效率的分析
            4.2 TgiPSCs和giPSCs生物學(xué)特征的比較
    第八章 轉(zhuǎn)基因克隆奶山羊來(lái)源的IPSCS參與核移植胚胎的發(fā)育
        1 引言
        2 材料與方法
            2.1 細(xì)胞株
            2.2 試劑耗材及溶液配制
            2.3 試驗(yàn)儀器
            2.4 試驗(yàn)方法
        3 試驗(yàn)結(jié)果
            3.1 不同來(lái)源的供體細(xì)胞對(duì)克隆胚胎融合率和卵裂率的影響
            3.2 giPSCs,tgiPSCs以及vivo-embryos內(nèi)源性多能基因表達(dá)差異
            3.3 TgFs和tgiPSCs核移植胚IGF家族基因表達(dá)的影響
            3.4 對(duì)tgFs,tgiPSCs和tgiPSCs來(lái)源的畸胎瘤進(jìn)行PCR檢測(cè)
        4 討論
            4.1 GiPSCs和tgiPSCs重編程效果的分析
            4.2 TgiPSCs對(duì)核移植胚胎發(fā)育的影響
參考文獻(xiàn)
全文結(jié)論
創(chuàng)新點(diǎn)和進(jìn)一步研究的課題
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號(hào)：3834213