杜泊綿羊作為優(yōu)質(zhì)的肉用品種深受養(yǎng)殖業(yè)青睞,但由于在日常生產(chǎn)中綿羊冷凍精液的受胎率普遍偏低制約了杜泊等優(yōu)秀品種及其凍精產(chǎn)品的推廣與普及。冷凍過程會給精子帶來一系列影響及損傷,有研究表明冷凍會使精子的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,損傷頭部的質(zhì)膜以及頂體,尾部的鞭毛和軸絲等結(jié)構(gòu),這些影響和損傷可能是導(dǎo)致冷凍精子受胎率偏低的部分原因。但目前對于冷凍精液質(zhì)量相關(guān)的研究大多集中在凍融形態(tài)學(xué)變化、改善外部儲存條件及優(yōu)化保護(hù)劑配比等方面,對于精子冷凍后受胎率下降的內(nèi)在機(jī)制研究尚不深入。隨著蛋白組學(xué)研究方法的不斷進(jìn)步,為深入研究精子冷凍后受胎率下降的內(nèi)在機(jī)制帶了新的機(jī)遇。本實(shí)驗將提取到的鮮精、凍精總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,將差異明顯的蛋白條帶通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)進(jìn)行鑒別,共得到489種蛋白,通過參考相關(guān)文獻(xiàn)、生信分析(質(zhì)譜結(jié)果分析、GO分析、KEGG分析)等方法篩選出幾種可能與綿羊冷凍精子質(zhì)量相關(guān)的蛋白,并對其基因進(jìn)行相對表達(dá)量測定。本實(shí)驗的研究目的在于為今后進(jìn)一步揭示綿羊精子冷凍凋亡或損傷的內(nèi)在機(jī)制提供部分理論依據(jù)。1.分別對凍精與鮮精進(jìn)行精子活率測定,利用伊紅活體染色聯(lián)合低滲腫脹實(shí)驗...

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
1 引言
    1.1 杜泊綿羊簡介
    1.2 精子
        1.2.1 精液的組成
        1.2.2 精子結(jié)構(gòu)
        1.2.3 精子發(fā)生
    1.3 精液凍存的原理
    1.4 冷凍精子的研究進(jìn)展
    1.5 精子凍融前后形態(tài)學(xué)變化以及精子質(zhì)量的評定指標(biāo)
        1.5.1 凍融前后的形態(tài)學(xué)變化
        1.5.2 精子質(zhì)量的評定指標(biāo)
    1.6 蛋白組學(xué)研究方法
        1.6.1 質(zhì)譜技術(shù)
    1.7 精子質(zhì)量相關(guān)蛋白
        1.7.1 微管蛋白(Tubulin)
        1.7.2 外周致密纖維蛋白(Outer dense fiber)
        1.7.3 筑絲蛋白(Tektins)
        1.7.4 己糖激酶(Hexokinase)
    1.8 本研究的主要內(nèi)容以及目的
    1.9 技術(shù)路線(圖2)
2 凍精、鮮精差異蛋白的研究
    2.1 實(shí)驗試劑與儀器
    2.2 試驗方法
        2.2.1 實(shí)驗動物及樣品采集
        2.2.2 冷凍精液的制備及解凍
            2.2.2.1 冷凍精子的制備
            2.2.2.2 冷凍精子解凍
        2.2.3 精子質(zhì)量的測定
            2.2.3.1 精子活率測定
            2.2.3.2 伊紅活體染色聯(lián)合低滲腫脹實(shí)驗測定精子質(zhì)膜完整性
        2.2.4 精子的純化
        2.2.5 凍精、鮮精總蛋白的提取
            2.2.5.1 溶液配制
            2.2.5.2 實(shí)驗步驟
        2.2.6 蛋白濃度的測定(Solarbio BCA蛋白濃度測定試劑盒)
        2.2.7 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
            2.2.7.1 實(shí)驗準(zhǔn)備
            2.2.7.2 操作步驟
        2.2.8 蛋白膠條切取
        2.2.9 膠條FASP酶解
        2.2.10 LC-MS/MS檢測及質(zhì)譜結(jié)果分析
        2.2.11 蛋白組學(xué)分析
    2.3 實(shí)驗結(jié)果
        2.3.1 精子質(zhì)量測定結(jié)果
            2.3.1.1 精子活率測定結(jié)果
            2.3.1.2 精子質(zhì)膜完整性測定
        2.3.2 精子濃度測定結(jié)果
        2.3.3 SDS-PAGE電泳結(jié)果及膠條切取
        2.3.4 質(zhì)譜分析結(jié)果
        2.3.5 鑒定到蛋白的GO注釋(圖9)
        2.3.6 鑒定到蛋白的Kegg Pathway富集(圖10)
        2.3.7 凍融精子質(zhì)量相關(guān)蛋白的篩選
3 凍精、鮮精差異基因表達(dá)量的研究
    3.1 實(shí)驗試劑與儀器
    3.2 試驗方法
        3.2.1 凍精、鮮精總RNA的提取
        3.2.2 凍精組、鮮精組PCR模板的制備
        3.2.3 PCR引物合成
        3.2.4 梯度PCR檢測退火溫度及引物特異性
        3.2.5 熒光定量PCR測定精子凍融前后質(zhì)量相關(guān)基因相對表達(dá)量
    3.3 小結(jié)
        3.3.1 RNA完整性檢測結(jié)果
        3.3.2 退火溫度摸索及引物特異性檢測結(jié)果
        3.3.3 精子冷凍前后質(zhì)量差異相關(guān)基因相對表達(dá)量檢測結(jié)果
4 討論
    4.1 冷凍后微管蛋白含量降低造成細(xì)胞損傷
    4.2 冷凍后精子運(yùn)動能力下降
        4.2.1 精子尾部相關(guān)蛋白下調(diào)導(dǎo)致精子運(yùn)動能力下降
        4.2.2 精子能量代謝相關(guān)蛋白下調(diào)導(dǎo)致精子運(yùn)動能力下降
致謝
參考文獻(xiàn)
作者簡介



本文編號：3834163