成骨細胞是蛋雞髓質骨形成的主要功能細胞,其功能受鈣離子的調節(jié)。Transient receptor potential vanilloid 6 (TRPV6)是鈣離子跨細胞轉運的限速“門控”通道。目前有關TRPV6對成骨細胞影響的報道主要集中在鼠及人類方面,對禽類國內、外很少報道。因此,本試驗通過將沉默TRPV6基因的質粒轉染至雞成骨細胞,檢測TRPV6對成骨細胞增殖、分化及凋亡的影響,旨在為探索蛋雞髓質骨形成提供理論基礎。兩次酶消化法培養(yǎng)雞成骨細胞,并用堿性磷酸酶染色及鈣化結節(jié)染色法鑒定培養(yǎng)的細胞。取16日齡雞胚顱骨,0.1%胰酶消化15 min后,剪碎,再用0.1%Ⅱ型膠原酶消化1h,獲取雞胚額骨成骨細胞群并鑒定。采用NBT/BCIP堿性磷酸酶染色試劑盒法對堿性磷酸酶進行染色,茜素紅法鑒定鈣化結節(jié)。選取生長狀態(tài)良好的成骨細胞,接種于96孔板,培養(yǎng)24 h,同時將成骨細胞分為3個試驗組,分別為用脂質體法轉染沉默TRPV6基因質粒組(TRPV6-shRNA質粒,轉染試劑,成骨細胞)、轉染未沉默TRPV6基因質粒組(negative-shRNA質粒,轉染試劑,成骨細胞)及未轉染組(轉染試...

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語
前言
上篇 文獻綜述
    第一章 鈣離子通道TRPV6研究進展
        1 TRPV6的發(fā)現(xiàn)
        2 TRPV6的結構和分布
        3 TRPV6的功能
    第二章 蛋雞髓質骨形成與成骨細胞的作用
        1 骨生長期
        2 產蛋期
    參考文獻
下篇 試驗研究
    第三章 雞成骨細胞的分離培養(yǎng)與鑒定
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 實驗動物
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 方法
                1.2.1 雞成骨細胞的分離培養(yǎng)
                1.2.2 雞成骨細胞的鑒定
        2 結果與分析
            2.1 雞成骨細胞形態(tài)
            2.2 堿性磷酸酶染色
            2.3 茜素紅法鑒定鈣化結節(jié)
        3 討論
            3.1 雞胚成骨細胞培養(yǎng)方法的完善
            3.2 雞成骨細胞的鑒定
        4 小結
    第四章 TRPV6對雞成骨細胞增殖、分化的影響
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 實驗動物
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 方法
                1.2.1 雞成骨細胞的分離培養(yǎng)
                1.2.2 培養(yǎng)的成骨細胞的鑒定
                1.2.3 質粒轉染成骨細胞
                1.2.4 MTT法測定細胞增殖率
                1.2.5 堿性磷酸酶活性定量測定(PNPP法)
                1.2.6 BCA法測定蛋白質含量
                1.2.7 統(tǒng)計學處理
        2 結果
            2.1 轉染成骨細胞
            2.2 TRPV6對成骨細胞增殖的影響
            2.3 TRPV6對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響
        3 討論
        4 小結
    第五章 TRPV6對雞成骨細胞凋亡的影響
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 實驗動物
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 方法
                1.2.1 雞成骨細胞的分離培養(yǎng)、鑒定及轉染
                1.2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測雞成骨細胞凋亡
        2 結果
            2.1 分離培養(yǎng)的成骨細胞觀察、鑒定及轉染
            2.2 TRPV6對雞成骨細胞凋亡的影響
        3 討論
        4 小結
    第六章 TRPV6對雞成骨細胞相關基因mRNA及蛋白表達的影響
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 實驗動物
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 方法
                1.2.1 雞成骨細胞的分離培養(yǎng)和鑒定及轉染
                1.2.2 實時熒光定量PCR檢測TRPV6相關基因mRNA表達
                1.2.3 Western blot檢測TRPV6相關基因蛋白表達
                1.2.4 統(tǒng)計學分析
        2 結果
            2.1 TRPV6對成骨細胞相關基因mRNA表達的影響
        4 小結
    參考文獻
全文總結
本論文創(chuàng)新之處
附錄
致謝
在讀碩士研究生期間發(fā)表文章及獲獎情況



本文編號：3821217