成骨細(xì)胞是蛋雞髓質(zhì)骨形成的主要功能細(xì)胞,其功能受鈣離子的調(diào)節(jié)。Transient receptor potential vanilloid 6 (TRPV6)是鈣離子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的限速“門控”通道。目前有關(guān)TRPV6對成骨細(xì)胞影響的報(bào)道主要集中在鼠及人類方面,對禽類國內(nèi)、外很少報(bào)道。因此,本試驗(yàn)通過將沉默TRPV6基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至雞成骨細(xì)胞,檢測TRPV6對成骨細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響,旨在為探索蛋雞髓質(zhì)骨形成提供理論基礎(chǔ)。兩次酶消化法培養(yǎng)雞成骨細(xì)胞,并用堿性磷酸酶染色及鈣化結(jié)節(jié)染色法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞。取16日齡雞胚顱骨,0.1%胰酶消化15 min后,剪碎,再用0.1%Ⅱ型膠原酶消化1h,獲取雞胚額骨成骨細(xì)胞群并鑒定。采用NBT/BCIP堿性磷酸酶染色試劑盒法對堿性磷酸酶進(jìn)行染色,茜素紅法鑒定鈣化結(jié)節(jié)。選取生長狀態(tài)良好的成骨細(xì)胞,接種于96孔板,培養(yǎng)24 h,同時將成骨細(xì)胞分為3個試驗(yàn)組,分別為用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染沉默TRPV6基因質(zhì)粒組(TRPV6-shRNA質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染試劑,成骨細(xì)胞)、轉(zhuǎn)染未沉默TRPV6基因質(zhì)粒組(negative-shRNA質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染試劑,成骨細(xì)胞)及未轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染試...

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語
前言
上篇 文獻(xiàn)綜述
    第一章 鈣離子通道TRPV6研究進(jìn)展
        1 TRPV6的發(fā)現(xiàn)
        2 TRPV6的結(jié)構(gòu)和分布
        3 TRPV6的功能
    第二章 蛋雞髓質(zhì)骨形成與成骨細(xì)胞的作用
        1 骨生長期
        2 產(chǎn)蛋期
    參考文獻(xiàn)
下篇 試驗(yàn)研究
    第三章 雞成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 方法
                1.2.1 雞成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)
                1.2.2 雞成骨細(xì)胞的鑒定
        2 結(jié)果與分析
            2.1 雞成骨細(xì)胞形態(tài)
            2.2 堿性磷酸酶染色
            2.3 茜素紅法鑒定鈣化結(jié)節(jié)
        3 討論
            3.1 雞胚成骨細(xì)胞培養(yǎng)方法的完善
            3.2 雞成骨細(xì)胞的鑒定
        4 小結(jié)
    第四章 TRPV6對雞成骨細(xì)胞增殖、分化的影響
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 方法
                1.2.1 雞成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)
                1.2.2 培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的鑒定
                1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞
                1.2.4 MTT法測定細(xì)胞增殖率
                1.2.5 堿性磷酸酶活性定量測定(PNPP法)
                1.2.6 BCA法測定蛋白質(zhì)含量
                1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
        2 結(jié)果
            2.1 轉(zhuǎn)染成骨細(xì)胞
            2.2 TRPV6對成骨細(xì)胞增殖的影響
            2.3 TRPV6對成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響
        3 討論
        4 小結(jié)
    第五章 TRPV6對雞成骨細(xì)胞凋亡的影響
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 方法
                1.2.1 雞成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)、鑒定及轉(zhuǎn)染
                1.2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測雞成骨細(xì)胞凋亡
        2 結(jié)果
            2.1 分離培養(yǎng)的成骨細(xì)胞觀察、鑒定及轉(zhuǎn)染
            2.2 TRPV6對雞成骨細(xì)胞凋亡的影響
        3 討論
        4 小結(jié)
    第六章 TRPV6對雞成骨細(xì)胞相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 方法
                1.2.1 雞成骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定及轉(zhuǎn)染
                1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測TRPV6相關(guān)基因mRNA表達(dá)
                1.2.3 Western blot檢測TRPV6相關(guān)基因蛋白表達(dá)
                1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        2 結(jié)果
            2.1 TRPV6對成骨細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響
        4 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
全文總結(jié)
本論文創(chuàng)新之處
附錄
致謝
在讀碩士研究生期間發(fā)表文章及獲獎情況



本文編號：3821217