絲狀支原體絲狀亞種(Mycoplasma mycoides subsp. Mycoides Small Colony,Mmm)是牛傳染性胸膜肺炎(contagious bovine pleuropneumonia, CBPP)的病原。CBPP是世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定的需報告?zhèn)魅静?目前,該病在非洲很多國家仍是一種重要的動物傳染病。中國利用Mmm中國分離株Ben-1在兔或綿羊體內連續(xù)傳代研制成“兔化綿羊化弱毒疫苗”并成功控制了CBPP的流行,于2011年5月被世界動物衛(wèi)生組織宣布為無牛肺疫國家,但目前Mmm傳代致弱的機制仍不明確。 本研究小組結合下一代測序技術以及比較基因組學,對Mmm中國分離株強毒株Ben-1以及致弱毒株Ben-470進行全基因組測序及序列比對,發(fā)現(xiàn)Ben-1和Ben-470之間存在30kb的基因缺失,從而推測這些基因的缺失可能與Ben-1菌株的毒力減弱相關。 在Ben-1和Ben-470基因組之間缺失的30kb片段中,我們選取其中的一個差異基因p19進行研究。本研究利用PCR、RT-PCR以及Dot blot雜交對p19基因在Ben-1和Ben-470全基因組中的差異情...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 絲狀支原體絲狀亞種(Mmm)概述
    1.2 牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)概述
        1.2.1 牛傳染性胸膜肺炎概述
        1.2.2 牛傳染性胸膜肺炎的流行病學
        1.2.3 中國弱毒CBPP疫苗的研制
        1.2.4 綿羊、藏綿羊化疫苗的發(fā)展和應用
    1.3 絲狀支原體絲狀亞種的致病分子機制
        1.3.1 絲狀支原體絲狀亞種的致病分子機制概述
        1.3.2 絲狀支原體絲狀亞種的免疫原性
        1.3.3 分泌型多糖以及莢膜多糖
        1.3.4 表面蛋白
        1.3.5 粘附因子
        1.3.6 表面可變蛋白
        1.3.7 毒素代謝通路產物
        1.3.8 細菌毒力的分解代謝物阻礙作用
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 P19的序列分析及原核表達
    2.1 材料
        2.1.1 菌株、質粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要設備儀器
        2.1.4 主要溶液及配置
    2.2 方法
        2.2.1 P19及其基因的序列分析
        2.2.2 Mmm基因組DNA的提取以及cDNA的制備
        2.2.3 p19基因的克隆
        2.2.4 p19基因的Dot blot雜交
        2.2.5 pET28a-p19重組質粒的構建及鑒定
        2.2.6 重組質粒pET-28a-p19的表達
        2.2.7 rP19可溶性判斷
        2.2.8 rP19的純化
    2.3 結果
        2.3.1 P19及其基因的序列分析
        2.3.2 p19基因克隆與分析
        2.3.3 p19基因的Dot blot雜交
        2.3.4 pET-28a-p19重組質粒的構建與鑒定
        2.3.5 rP19的原核表達與純化
    2.4 小結
    2.5 討論
第三章 P19多克隆抗體制備及亞細胞定位
    3.1 材料
        3.1.1 主要試劑
        3.1.2 實驗設備
        3.1.3 相關溶液及配制方法
    3.2 方法
        3.2.1 兔抗rP19多克隆抗體的制備
        3.2.2 兔抗rP19血清效價的測定
        3.2.3 Mmm的細胞總蛋白、膜蛋白及胞漿蛋白組分的提取
        3.2.4 Mmm P19的細胞定位
    3.3 結果
        3.3.1 兔抗rP19血清效價的測定
        3.3.2 Mmm P19的細胞定位
    3.4 小結
    3.5 討論
第四章 P19對宿主細胞粘附特性及免疫功能的研究
    4.1 材料
        4.1.1 菌株與細胞
        4.1.2 試劑
        4.1.3 血清
        4.1.4 主要儀器
    4.2 方法
        4.2.1 rP19粘附EBL細胞
        4.2.2 夾心ELISA實驗
        4.2.3 rP19的Western Blot檢測
        4.2.4 rP19的ELISA檢測
        4.2.5 P19刺激EBL細胞
        4.2.6 SYBR Green I實時定量PCR
        4.2.7 相對mRNA表達水平的計算
    4.3 結果
        4.3.1 rP19粘附EBL細胞
        4.3.2 夾心ELISA實驗
        4.3.3 rP19的Western Blot檢測
        4.3.4 rP19的ELISA檢測
        4.3.5 rP19激活EBL細胞IL-1β和TNF-α的mRNA上調表達
    4.4 結論
    4.5 討論
第五章 全文結論
參考文獻
致謝
作者簡歷



本文編號：3818594