發(fā)布時間：2017-05-20 12:22

  本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)酸性木聚糖酶鏈霉菌的鑒定、產(chǎn)酶條件優(yōu)化及其基因克隆與表達(dá)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：半纖維素在秸稈中含量僅次于纖維素,是地球上第二大類可再生自然資源有機物。但大多數(shù)作為廢棄物被浪費。我國擁有豐富的秸稈資源,但大多數(shù)作為廢棄物被浪費,或者被焚燒對環(huán)境造成極大的威脅。如何有效利用秸稈中的半纖維素,將其轉(zhuǎn)化為可利用的資源和能源是一個亟待解決的問題。植物半纖維素可被以木聚糖酶為主的半纖維素酶降解,木聚糖酶在造紙工業(yè)、食品行業(yè)、飼料添加劑等領(lǐng)域中顯示的諸多應(yīng)用價值不可小覷。本研究從土樣和灘羊瘤胃內(nèi)容物中分離產(chǎn)木聚糖酶的菌株,并對產(chǎn)酶水平高的菌株進(jìn)行種屬鑒定,同時分析其所產(chǎn)酶的酶學(xué)特性、產(chǎn)酶條件優(yōu)化,并研究其所產(chǎn)木聚糖酶對三種粗飼料(麥秸、玉米秸稈、苜蓿草粉)的降解效果,通過分子生物技術(shù)克隆編碼木聚糖酶的基因,并將其在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá),對其重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行評價,為該酶作為酶制劑應(yīng)用于粗纖維飼料降解提供依據(jù)。試驗結(jié)果如下:1.試驗采用剛果紅染色法和發(fā)酵液法從灘羊瘤胃內(nèi)容物及土壤中篩選到6株能夠分解木聚糖的細(xì)菌,其中分離于土壤中的菌株WL003,酶活高達(dá)20.68 U/mL。通過生理生化特性及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建進(jìn)行種屬鑒定,鑒定為灰略紅鏈霉菌,屬于革蘭氏陽性菌。2.菌株WL003適宜在pH為6.0、培養(yǎng)溫度32℃、180 rpm條件下生長,發(fā)酵7 d達(dá)到產(chǎn)酶高峰,以麥秸(10%)為碳源、牛肉膏為氮源進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng),并且在發(fā)酵培養(yǎng)液中添加0.1%的吐溫-80能夠使菌株表現(xiàn)更好的產(chǎn)酶能力,經(jīng)過優(yōu)化酶活提高了2.46倍。粗酶液對麥秸的降解效果最好,苜蓿草粉最差。3.菌株WL003分泌的木聚糖酶最適溫度為65℃,最適pH值為4.5,經(jīng)30℃~55℃處理10 min,殘余酶活不低于80%;經(jīng)pH 3.5~11.0范圍內(nèi)處理1.5 h后,殘余酶活不低于88%;吐溫-80可激活木聚糖酶活力,Cu2+、SDS及β-巰基乙醇則極大地抑制酶活。4.克隆了灰略紅鏈霉菌WL003木聚糖酶基因xyn130,完整的閱讀框全長1320 bp,編碼氨基酸439個,理論的分子量和pI分別為47.25 kDa和5.86;基因xyn130編碼的蛋白為親水性穩(wěn)定蛋白,有3個糖基化位點,20個磷酸化位點。該酶屬于糖苷水解酶家族GH10,Glu-170、Glu-278和Asn-343為XYN130可能的催化殘基,具有GH10家族典型的(β/α)8構(gòu)型。5.構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-xyn130,經(jīng)轉(zhuǎn)化實現(xiàn)其在E.coli BL21(DE3)中的分泌表達(dá),在0.2 mmol/L IPTG條件下誘導(dǎo)時間為6 h,獲得最高誘導(dǎo)酶活。重組木聚糖酶最適溫度為60℃,最適pH為5.5。在30℃~75℃范圍內(nèi)有較好的耐熱性,對于75℃以上表現(xiàn)不耐受;在pH 3.5~11.0范圍內(nèi)耐受性很好,對于pH 3.0和pH 12.0表現(xiàn)極不耐受;Cu2+、SDS、β-巰基乙醇、EDTA、Mn2+和Zn2+不同程度地抑制重組酶酶活,其中Cu2+表現(xiàn)為極強抑制,SDS強抑制。結(jié)論:采用剛果紅染色法從土樣選育到一株產(chǎn)酸性木聚糖酶的灰略紅鏈霉菌WL003,優(yōu)化后酶活提高了2.46倍,發(fā)酵液對麥秸降解效果最理想,苜蓿草粉最差。成功克隆了木聚糖酶基因xyn130(NO.KU860088),該基因全長1320 bp,連續(xù)編碼439個氨基酸,理論分子量為47.25 kDa,等電點pI為5.86。成功實現(xiàn)木聚糖酶基因xyn130在大腸桿菌中的表達(dá),重組酶最適溫度和pH分別為60℃和5.5,SDS較大程度地抑制酶活,而Cu2+則使酶徹底失活。
【關(guān)鍵詞】：鏈霉菌 木聚糖酶 種屬鑒定 產(chǎn)酶條件優(yōu)化 基因克隆 原核表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S816.3
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-25
• 1.1 半纖維簡介13-15
• 1.1.1 半纖維素概念13-14
• 1.1.2 木聚糖的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)14-15
• 1.2 木聚糖酶研究進(jìn)展15-21
• 1.2.1 木聚糖酶的分類15-16
• 1.2.2 木聚糖酶的來源及分子結(jié)構(gòu)16-17
• 1.2.3 木聚糖酶的分子生物學(xué)和基因克隆17-21
• 1.3 木聚糖酶的研究現(xiàn)狀21-23
• 1.3.1 木聚糖酶在畜牧業(yè)中的應(yīng)用21-23
• 1.3.2 木聚糖酶在造紙工業(yè)上的應(yīng)用23
• 1.3.3 木聚糖酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用23
• 1.4 本研究的目的和意義23-25
• 第二章 產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選及鑒定25-31
• 2.1 材料25
• 2.1.1 樣品采集25
• 2.1.2 主要儀器25
• 2.1.3 主要試劑25
• 2.1.4 培養(yǎng)基和主要溶液的配制25
• 2.2 方法25-26
• 2.2.1 菌株初篩、純化及復(fù)篩25-26
• 2.2.2 繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線26
• 2.2.3 測定粗酶液酶活26
• 2.2.4 菌株的形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特征和生理生化鑒定26
• 2.2.5 菌株的種屬鑒定26
• 2.3 結(jié)果與分析26-30
• 2.3.1 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制26-27
• 2.3.2 木聚糖分解菌的篩選27-28
• 2.3.3 菌株形態(tài)學(xué)鑒定28
• 2.3.4 培養(yǎng)特征和生理生化特征28-29
• 2.3.5 菌株WL003的 16S rDNA序列分析29-30
• 2.4 討論30
• 2.5 小結(jié)30-31
• 第三章 鏈霉菌木聚糖酶酶學(xué)特性及產(chǎn)酶條件優(yōu)化分析31-41
• 3.1 材料31
• 3.1.1 菌株來源31
• 3.1.2 主要儀器31
• 3.1.3 主要試劑31
• 3.2 方法31-32
• 3.2.1 菌株WL003木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析31-32
• 3.2.2 菌株WL003產(chǎn)酶條件優(yōu)化32
• 3.2.3 菌株WL003產(chǎn)木聚糖酶對粗纖維的降解效果測定32
• 3.2.4 數(shù)據(jù)分析32
• 3.3 結(jié)果與分析32-38
• 3.3.1 菌株WL003所產(chǎn)木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析32-35
• 3.3.2 鏈霉菌WL003的產(chǎn)酶條件優(yōu)化35-38
• 3.3.3 粗纖維降解效果的分析38
• 3.4 討論38-40
• 3.4.1 野生菌分泌的木聚糖酶酶學(xué)特性分析38-39
• 3.4.2 發(fā)酵條件對鏈霉菌WL003的產(chǎn)酶影響39-40
• 3.5 小結(jié)40-41
• 第四章 木聚糖酶基因克隆與表達(dá)41-55
• 4.1 材料41
• 4.1.1 菌株和質(zhì)粒41
• 4.1.2 主要試劑41
• 4.1.3 主要儀器41
• 4.1.4 引物41
• 4.2 方法41-43
• 4.2.1 木聚糖酶基因PCR擴增41-42
• 4.2.2 雙酶切體系和連接體系42
• 4.2.3 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備方法42
• 4.2.4 木聚糖酶基因在大腸桿菌的誘導(dǎo)表達(dá)42-43
• 4.2.5 重組木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)分析43
• 4.3 序列相關(guān)生物信息學(xué)分析43
• 4.3.1 xyn130基因序列分析43
• 4.3.2 XYN130的親水性/疏水性分析43
• 4.3.3 XYN130磷酸化位點預(yù)測43
• 4.3.4 XYN130的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測43
• 4.3.5 XYN130的同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育樹分析43
• 4.4 結(jié)果與分析43-53
• 4.4.1 WL003木聚糖酶基因xyn130的克隆43-44
• 4.4.2 序列相關(guān)生物信息學(xué)分析44-48
• 4.4.3 木聚糖酶基因xyn130在大腸桿菌BL21（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá)48-50
• 4.4.4 重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析50-53
• 4.5 討論53-54
• 4.5.1 木聚糖酶的基因克隆53
• 4.5.2 重組木聚糖酶在大腸桿菌中的原核表達(dá)53-54
• 4.5.3 重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)分析54
• 4.6 小結(jié)54-55
• 第五章 結(jié)論、創(chuàng)新點以及進(jìn)一步研究內(nèi)容55-56
• 5.1 結(jié)論55
• 5.2 創(chuàng)新點55
• 5.3 進(jìn)一步研究內(nèi)容55-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 附錄63-71
• 致謝71-72
• 作者簡介72

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1 王丹梅;任大明;李秀娜;石皎;;木質(zhì)素高效降解菌血紅密孔菌產(chǎn)酶條件研究（英文）[J];Agricultural Science & Technology;2008年01期

2 陳吉剛;張蓉蓉;楊季芳;毛芝娟;;北冰洋產(chǎn)淀粉酶海洋細(xì)菌的篩選與鑒定及其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化(摘要)(英文)[J];Agricultural Science & Technology;2010年08期

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7 黃繼，

本文編號：381623