本文關(guān)鍵詞：豬δ冠狀病毒E和S1蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬δ冠狀病毒(Porcine Deltacoronaviruses,PDCoV)屬于冠狀病毒科δ冠狀病毒屬,2012年在香港的豬群中檢測(cè)到該病毒,并于2014年在美國(guó)爆發(fā)后在全世界范圍傳播。目前還沒(méi)有可用于豬δ冠狀病毒診斷和預(yù)防的商用試劑或疫苗,因此對(duì)豬δ冠狀病毒疫苗和診斷方法的研究是非常重要的。豬δ冠狀病毒E蛋白和S蛋白是該病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白,在病毒成熟過(guò)程中S蛋白被蛋白酶切割成S1和S2,S2區(qū)域比較保守,抗原位點(diǎn)和變異區(qū)主要在S1區(qū)域;E蛋白是小包膜蛋白,對(duì)于豬δ冠狀病毒在宿主的組裝和侵染有重要作用。本研究將豬δ冠狀病毒HKU15-44株E蛋白和S1蛋白作為抗原分別免疫新西蘭兔,并對(duì)兔子產(chǎn)生的抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。研究結(jié)果如下:1豬δ冠狀病毒E蛋白載體構(gòu)建與表達(dá)本研究合成的質(zhì)粒pET21b-pSUMO-CoVE所表達(dá)的目的蛋白可溶性部分占比87%,可溶性良好但目的蛋白不便于純化。利用PCR的方法將6×His標(biāo)簽與pET21b-pSUMO-CoVE質(zhì)粒重組構(gòu)建pET21b-6×His-pSUMO-CoVE重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)。誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè),結(jié)果表明成功構(gòu)建了pET21b-6×His-pSUMO-CoVE重組質(zhì)粒,并表達(dá)和純化出His-CoVE目的蛋白,該蛋白分子量為56 KD,為研究豬δ冠狀病毒E蛋白的免疫作用提供基礎(chǔ)。2豬δ冠狀病毒S1蛋白載體構(gòu)建與表達(dá)本研究合成了pET21b-pSUMO-CoVS1質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)和灰度分析,pET21b-pSUMO-CoVS1所表達(dá)的目的蛋白可溶部分占比34%。為了促進(jìn)目的蛋白的可溶性,利用載體重組的方法將CoVS1基因與八個(gè)可溶性標(biāo)簽相連構(gòu)建了八個(gè)重組質(zhì)粒:pET21b-6×His-Grifin-CoVS1、pET21b-6×His-GST-CoVS1、pET21b-6×His-MBP-CoVS1、pET21b-6×Hi s-SUMO-CoVS1、pET21b-6×His-Thioredoxin-CoVS1、pET21b-6×His-γ-crystallin-CoVS1、pE T21b-6×His-Ars C-CoVS1、pET21b-6×His-Ppi B-CoVS1。酶切鑒定結(jié)果表明成功構(gòu)建了八個(gè)重組質(zhì)粒,經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)和灰度分析,pET21b-6×His-MBP-CoVS1融合表達(dá)效果最好,目的蛋白可溶部分占比62%,與pET21b-pSUMO-CoVS1質(zhì)粒相比融合蛋白可溶性提高1.8倍,并且成功純化出MBP-CoVS1重組蛋白,MBP-CoVS1重組蛋白可用于下一步免疫試驗(yàn)。3豬δ冠狀病毒E蛋白和S1蛋白免疫效果研究His-CoVE和MBP-CoVS1重組蛋白分別經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)和純化后,與弗氏佐劑等體積混勻制備疫苗,每只1mg重組蛋白免疫新西蘭兔。四免后一周采血分離血清,以Western-blot和ELISA方法檢測(cè)免疫效果,以His-CoVE和MBP-CoVS1重組蛋白為抗原,分離的血清作為一抗,Western-blot結(jié)果表明His-CoVE和MBP-CoVS1在相應(yīng)位置均有陽(yáng)性條帶;以豬δ冠狀病毒CH-01包被抗原,分離的血清作為一抗,ELISA檢測(cè)MBP-CoVS1組免疫后血清效價(jià)達(dá)到1:6400,His-CoVE組免疫后血清效價(jià)達(dá)到1:3200,均顯著的高于對(duì)照組。本研究分離的血清可作為多克隆抗體用于PDCoV的診斷研究與中和試驗(yàn),為PDCoV的診斷與預(yù)防提供理論基礎(chǔ)和參考。
【關(guān)鍵詞】：豬δ冠狀病毒 S1蛋白 E蛋白 融合標(biāo)簽 多克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 縮略詞4-5
• 致謝5-9
• 摘要9-11
• 1 文獻(xiàn)綜述11-19
• 1.1 冠狀病毒11-12
• 1.2 豬δ冠狀病毒12-14
• 1.2.1 豬δ冠狀病毒發(fā)現(xiàn)與流行狀況12-13
• 1.2.2 豬δ冠狀病毒基因組特征13
• 1.2.3 豬δ冠狀病毒感染臨床癥狀13-14
• 1.2.4 豬δ冠狀病毒的診斷方法14
• 1.3 冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白14-16
• 1.3.1 Spike刺突糖蛋白14-15
• 1.3.2 M蛋白15
• 1.3.3 E蛋白15
• 1.3.4 N蛋白15-16
• 1.4 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)及融合標(biāo)簽16-19
• 1.4.1 多聚組氨酸標(biāo)簽17
• 1.4.2 Grifin標(biāo)簽17
• 1.4.3 GST標(biāo)簽17
• 1.4.4 MBP標(biāo)簽17-18
• 1.4.5 SUMO標(biāo)簽18
• 1.4.6 Thioredoxin標(biāo)簽18
• 1.4.7 γ-crystallin標(biāo)簽18
• 1.4.8 ArsC標(biāo)簽18
• 1.4.9 PpiB標(biāo)簽18-19
• 2 引言19-20
• 3 材料與方法20-30
• 3.1 材料20-23
• 3.1.1 質(zhì)粒和菌株20
• 3.1.2 主要儀器設(shè)備20
• 3.1.3 試劑20-23
• 3.1.3.1 主要試劑20-21
• 3.1.3.2 常規(guī)試劑及配制方法21-23
• 3.2 冠狀病毒E蛋白的載體構(gòu)建與表達(dá)23-26
• 3.2.1 合成目的基因23
• 3.2.2 PDCoV的E蛋白可溶性鑒定23-24
• 3.2.2.1 誘導(dǎo)表達(dá)23-24
• 3.2.2.2 純化蛋白24
• 3.2.3 構(gòu)建冠狀病毒E蛋白載體24-25
• 3.2.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成24
• 3.2.3.2 PCR擴(kuò)增24-25
• 3.2.3.3 構(gòu)建重組質(zhì)粒His-CoVE25
• 3.2.4 冠狀病毒E蛋白的表達(dá)與純化25-26
• 3.2.4.1 冠狀病毒E蛋白的表達(dá)25-26
• 3.2.4.2 冠狀病毒E蛋白的純化26
• 3.3 冠狀病毒S1蛋白的載體構(gòu)建與表達(dá)26-28
• 3.3.1 合成目的基因26
• 3.3.2 PDCoV的S1蛋白可溶性鑒定26-27
• 3.3.3 構(gòu)建冠狀病毒S1蛋白的載體27
• 3.3.4 冠狀病毒S1蛋白的表達(dá)與純化27-28
• 3.3.4.1 冠狀病毒S1蛋白的可溶性標(biāo)簽篩選27-28
• 3.3.4.2 冠狀病毒S1蛋白的純化28
• 3.4 冠狀病毒E和S1蛋白免疫作用的研究28-30
• 3.4.1 冠狀病毒E和S1蛋白疫苗的制備28
• 3.4.2 動(dòng)物分組及免疫28
• 3.4.3 冠狀病毒E和S1蛋白免疫效果28-29
• 3.4.4 免疫血清抗體效價(jià)檢測(cè)29-30
• 4 結(jié)果與分析30-39
• 4.1 冠狀病毒E蛋白的載體構(gòu)建與表達(dá)鑒定30-34
• 4.1.1 冠狀病毒E可溶性鑒定30-31
• 4.1.2 冠狀病毒E蛋白載體構(gòu)建31-32
• 4.1.2.1 CoVE目的基因PCR結(jié)果31
• 4.1.2.2 載體雙酶切結(jié)果31-32
• 4.1.2.2 His-CoVE菌液PCR鑒定結(jié)果32
• 4.1.3 E蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果32-34
• 4.1.3.1 His-CoVE的表達(dá)結(jié)果32-33
• 4.1.3.2 His-CoVE的純化結(jié)果33-34
• 4.2 冠狀病毒S1蛋白的載體構(gòu)建與表達(dá)鑒定34-38
• 4.2.1 冠狀病毒S1蛋白可溶性鑒定34
• 4.2.2 冠狀病毒S1蛋白的載體構(gòu)建34-36
• 4.2.2.1 pET21b-pSUMO-CoVS1和標(biāo)簽載體的雙酶切結(jié)果34-35
• 4.2.2.2 CoVS1融合標(biāo)簽載體的雙酶切鑒定結(jié)果35-36
• 4.2.3 冠狀病毒S1蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果36-38
• 4.2.3.1 冠狀病毒S1蛋白的可溶性標(biāo)簽篩選36-37
• 4.2.3.2 冠狀病毒S1蛋白的純化效果37-38
• 4.3 冠狀病毒E和S1蛋白免疫作用的研究38-39
• 4.3.1 冠狀病毒E和S1蛋白免疫效果38
• 4.3.2 免疫血清抗體效價(jià)檢測(cè)38-39
• 5 結(jié)論與討論39-41
• 5.1 討論39-40
• 5.2 結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-50
• 英文摘要50-51

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  本文關(guān)鍵詞：豬δ冠狀病毒E和S1蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：380938