旨在篩選并鑒定與鴨C4結(jié)合蛋白(C4b-binding protein,C4BP)互作的鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,R.anatipestifer)外膜蛋白。本研究將保存的R.anatipestifer復(fù)蘇培養(yǎng),提取外膜蛋白,以鴨C4BPα作為誘餌蛋白進行His pull-down及LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定,篩選與鴨C4BP可能發(fā)生互作的候選外膜蛋白;將各候選蛋白進行克隆、原核表達,免疫小鼠制備多克隆抗體,利用Far-western blot驗證與鴨C4BP發(fā)生相互作用的R.anatipestifer外膜蛋白;針對候選蛋白及C4BPα各功能結(jié)構(gòu)域進行克隆及原核表達,利用Far-western blot鑒定候選蛋白及與C4BP的相互作用位點;利用ELISA對補體因子C3b、C4b及C4BP在R.anatipestifer表面沉積情況進行測定,驗證候選蛋白的功能。結(jié)果顯示,經(jīng)His pull-down及LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜分析,共篩選出3個與鴨C4BP發(fā)生相互作用的R.anatipestifer外膜蛋白,即ECE-1、SODs和Omp62;成功獲...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 試驗動物
        1.1.2 菌株和載體
        1.1.3 主要試劑
    1.2 方法
        1.2.1 R. anatipestifer外膜蛋白的提取
        1.2.2 His pull-down試驗篩選R.
        1.2.3 蛋白質(zhì)譜鑒定R.
        1.2.4 候選蛋白編碼基因原核表達及多克隆抗體制備
        1.2.5 Far-western blot鑒定R.anatipestifer與C4BP的相互作用
        1.2.6 R. anatipestifer外膜蛋白ECE-1與C4BP相互作用的位點鑒定
2 結(jié) 果
    2.1 與C4BP互作的R. anatipestifer候選外膜蛋白的篩選
    2.2 候選蛋白ECE-1、SODs及Omp62多克隆抗體制備
    2.3 Far-western blot鑒定候選外膜蛋白與C4BP的相互作用
    2.4 ECE-1與C4BP相互作用位點的鑒定
    2.5 ECE-1抗體對補體因子沉積的影響
3 討 論
4 結(jié) 論



本文編號：3815154