發(fā)布時間：2023-05-07 07:53

　　為了利用綿羊卵巢酵母雙雜交cDNA文庫篩選與FHL2蛋白相互作用的宿主蛋白,構(gòu)建重組誘餌載體pGBKT7-FHL2,試驗從綿羊卵巢組織中提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,依據(jù)FHL2基因核苷酸序列設(shè)計特異性引物,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增FHL2目的片段,連接到經(jīng)限制性內(nèi)切酶EocRⅠ和BamHⅠ酶切后的酵母空載體pGBKT7上,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,進(jìn)行PCR鑒定及測序比對分析,將構(gòu)建好的重組誘餌載體pGBKT7-FHL2轉(zhuǎn)化到酵母Y2HGlod感受態(tài)細(xì)胞中,利用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測其表達(dá)情況、自激活活性及細(xì)胞毒性。結(jié)果表明:PCR擴(kuò)增出大小約為876 bp的目的條帶;成功構(gòu)建出重組誘餌載體pGBKT7-FHL2,測序結(jié)果與NCBI中預(yù)測的FHL2堿基序列同源性為100%;重組誘餌載體pGBKT7-FHL2可在酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞中表達(dá)FHL2蛋白,對酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞無自激活活性和毒性作用。說明試驗成功構(gòu)建出重組誘餌載體pGBKT7-FHL2,通過檢測證明該重組誘餌載體能夠用于酵母雙雜交系統(tǒng)篩選互作蛋白。

【文章頁數(shù)】：7 頁

【文章目錄】：
1 材料
    1.1 樣本和菌株
    1.2 主要試劑
    1.3 主要儀器
2 方法
    2.1 引物的設(shè)計與合成
    2.2 FHL2基因的PCR擴(kuò)增及重組誘餌載體pGBKT7-FHL2的構(gòu)建
    2.3 重組誘餌載體pGBKT7-FHL2轉(zhuǎn)化至酵母Y2HGold 感受態(tài)細(xì)胞
    2.4 FHL2誘餌蛋白表達(dá)的檢測
    2.5 重組誘餌載體pGBKT7-FHL2對報告基因自激活活性的檢測
    2.6 重組誘餌載體pGBKT7-FHL2對酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞毒性的檢測
3 結(jié)果與分析
    3.1 FHL2基因的PCR擴(kuò)增
    3.2 重組誘餌載體pGBKT7-FHL2的構(gòu)建
    3.3 重組誘餌載體pGBKT7-FHL2轉(zhuǎn)化至酵母Y2HGold 感受態(tài)細(xì)胞
    3.4 FHL2誘餌蛋白表達(dá)的檢測
    3.5 重組誘餌載體pGBKT7-FHL2對報告基因自激活活性的檢測
    3.6 重組誘餌載體pGBKT7-FHL2對酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞毒性的檢測
4 討論與結(jié)論



本文編號：3810594