自然殺傷(Natural killer, NK)細(xì)胞是一類重要的淋巴細(xì)胞,在抗病毒和疾病的遺傳抗性中具有重要作用。然而,至今,對(duì)NK細(xì)胞的認(rèn)識(shí)大多來(lái)源于小鼠和人類,并不清楚這些認(rèn)識(shí)是否適用于其他動(dòng)物。雞是非哺乳動(dòng)物中禽類的代表動(dòng)物,至今對(duì)雞NK細(xì)胞了解不多。已有的證據(jù)表明,雞NK細(xì)胞與哺乳動(dòng)物NK細(xì)胞差異巨大。由于缺乏特異性抗體,14日齡雞胚脾臟是雞NK細(xì)胞的主要來(lái)源,并主要根據(jù)形態(tài)學(xué)和功能學(xué)進(jìn)行鑒定。雞NK細(xì)胞在多種疾病中具有重要作用,而BNK等C型凝結(jié)素基因在雞主要相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex, MHC)和NK細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)暗示雞NK細(xì)胞可能在疾病的遺傳抗性中扮演重要角色。 本研究利用實(shí)驗(yàn)室建立的SPF B19和B21MHC單倍型雞,收集14日齡雞胚新鮮脾臟,并用冷胰酶消化法分離收獲淋巴細(xì)胞,并在添加條件培養(yǎng)基和雞重組IL-2的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后,收獲懸浮細(xì)胞,既為雞NK細(xì)胞。流式前向角和側(cè)向角分析顯示培養(yǎng)的細(xì)胞中85.1%的細(xì)胞大小均一,顆粒度一致；瑞氏吉姆薩染料染色結(jié)果表明收獲的細(xì)胞內(nèi)一側(cè)含有嗜酸性大顆粒,符合雞NK細(xì)胞的形...

【文章頁(yè)數(shù)】：49 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 研究的目的和意義
    1.2 NK細(xì)胞研究現(xiàn)狀
        1.2.1 NK細(xì)胞的概述
        1.2.2 NK細(xì)胞的表面標(biāo)記
        1.2.3 NK細(xì)胞受體
        1.2.4 NK細(xì)胞的識(shí)別
    1.3 雞NK細(xì)胞
        1.3.1 雞NK細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 雞NK細(xì)胞與抗病毒感染
        1.3.3 雞NK細(xì)胞的受體
第二章 雞NK細(xì)胞的分離培養(yǎng)及表型鑒定
    2.1 材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 雞胚脾臟淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
        2.2.2 雞NK細(xì)胞的鑒定
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定
        2.3.2 細(xì)胞免疫表型鑒定
    2.4 討論
第三章 雞NK細(xì)胞靶細(xì)胞的篩選及其殺傷機(jī)制分析
    3.1 材料
        3.1.1 動(dòng)物及細(xì)胞
        3.1.2 主要試劑
    3.2 方法
        3.2.1 效應(yīng)細(xì)胞的制備
        3.2.2 CFSE工作濃度的優(yōu)化及標(biāo)記靶細(xì)胞
        3.2.3 Triton 100的工作濃度的優(yōu)化
        3.2.4 雞NK細(xì)胞靶細(xì)胞的篩選
        3.2.5 B21雞NK細(xì)胞與B19雞細(xì)胞體外殺傷活性的比較
        3.2.6 雞NK細(xì)胞對(duì)YAC-1殺傷機(jī)制的分析
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 CFSE工作濃度的優(yōu)化
        3.3.2 Triton 100的工作濃度的測(cè)定
        3.3.3 雞NK細(xì)胞的細(xì)胞殺傷功能
        3.3.4 MHC—B單倍型雞NK細(xì)胞的細(xì)胞殺傷活性比較
        3.3.5 雞NK細(xì)胞的細(xì)胞殺傷機(jī)制
    3.4 討論
        3.4.1 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK細(xì)胞殺傷活性
        3.4.2 雞NK細(xì)胞跨物種殺傷小鼠源靶細(xì)胞YAC-1細(xì)胞不殺傷人源K562細(xì)胞
        3.4.3 B21單倍型雞NK細(xì)胞細(xì)胞殺傷活性強(qiáng)于B19
        3.4.4 雞NK細(xì)胞對(duì)YAC-1細(xì)胞系的殺傷與YAC-1細(xì)胞表面MHC Ⅰ類分子和活化性配體H60和RAE-1無(wú)關(guān)
第四章 B19和B21雞NK細(xì)胞受體BNK的表達(dá)及兔多抗制備
    4.1 材料
        4.1.1 菌株、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要設(shè)備
        4.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成
    4.2 方法
        4.2.1 BNK19和BNK21基因的RT-PCR擴(kuò)增
        4.2.2 原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE電泳
        4.2.4 重組蛋白對(duì)His單抗的Western blot檢測(cè)
        4.2.5 BNK重組蛋白兔多克隆抗體的制備
        4.2.6 多抗特異性的Western blot檢測(cè)
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 BNK19和BNK21基因片段分析和PCR擴(kuò)增結(jié)果
        4.3.2 BNK19和BNK21重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)
        4.3.3 重組蛋白對(duì)標(biāo)簽His單抗的Western b1ot檢測(cè)
        4.3.4 兔多克隆抗體的制備
    4.4 討論
第五章 全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介



本文編號(hào)：3801008