發(fā)布時間：2023-04-18 21:12

　　奶牛乳腺乳脂代謝受到諸多因素的調控,是十分復雜的過程。SIRT1基因是具有乙酰化作用的沉默信息調控子。SIRT1基因在脂肪細胞中高表達,在部分哺乳動物體內起到抑制脂肪生成的作用。目前關于SIRT1基因在奶牛乳腺上皮細胞中對乳脂代謝調控作用的研究報道較少。MicroRNA(miRNA)是一類轉錄后調控的非編碼RNA,其可以通過調控靶基因的表達而間接地影響乳脂代謝過程。本實驗室前期利用高通量測序技術分別對泌乳前7天和泌乳180天奶牛乳腺組織中miRNA的表達模式進行鑒定,分析得到bta-miR-141顯著差異表達(P<0.05)。生物信息學分析表明,bta-miR-141靶向調控SIRT1基因。本研究以奶牛乳腺上皮細胞及人腎上皮細胞系(293T)為研究對象,運用甘油三酯含量測定、油紅O染色、熒光定量PCR(qRT-PCR)、雙熒光素酶報告基因以及免疫印跡等試驗技術,研究bta-miR-141靶向SIRT1基因調控奶牛乳腺上皮細胞乳脂代謝的機制。所得結果如下:1、bta-miR-141功能探究:奶牛乳腺上皮細胞中分別轉染miR-141模擬物(mimic)、陰性對照(mimic-NC)。...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
常用詞語縮寫
第一章 文獻綜述
    1 乳脂肪概述
        1.1 乳脂肪合成途徑
        1.2 乳脂肪合成關鍵轉錄因子的研究進展
    2 Sirtuin家族及SIRT1基因的研究進展
        2.1 Sirtuin家族基因的結構特征
        2.2 Sirtuin家族基因的功能概述
        2.3 Sirtuin家族基因對組織、器官以及個體發(fā)育的影響
        2.4 Sirtuin家族成員的應用及發(fā)展方向
        2.5 去乙�；窼IRT1的結構、表達與定位
        2.6 SIRT1基因與脂代謝
        2.7 SIRT1 -SREBP-1c通路
        2.8 SIRT1 -PGC-1α通路
    3 microRNA與乳脂代謝
        3.1 microRNA的生物合成
        3.2 microRNA的作用機制
        3.3 microRNA的調控功能研究
        3.4 microRNA在動物脂肪組織及乳腺組織中的研究
        3.5 microRNA的靶基因預測與驗證
        3.6 miR-141的研究進展
    4 研究的目的、研究思路及技術路線
        4.1 研究的目的與意義
        4.2 研究思路
        4.3 技術路線
第二章 bta-miR-141在奶牛乳腺上皮細胞中的功能探究
    1 材料與方法
        1.1 試驗試劑與配置、儀器
        1.2 試驗細胞
        1.3 引物
        1.4 奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)
            1.4.1 細胞復蘇
            1.4.2 細胞傳代
            1.4.3 細胞凍存
        1.5 差異表達miRNA的生物信息學篩選
        1.6 bta-miR-141在奶牛乳腺上皮細胞中的轉染
        1.7 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)
            1.7.1 細胞總RNA的提取
            1.7.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA質量
            1.7.3 mRNA反轉錄成cDNA
            1.7.4 miRNA反轉錄成cDNA
            1.7.5 Real-time PCR
        1.8 甘油三酯測定
        1.9 油紅O染色
        1.10 統(tǒng)計分析
    2 結果
        2.1 奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)
        2.2 qRT-PCR檢測牛乳腺上皮細胞中miR-141的過表達和抑制表達效果
        2.3 轉染miR-141 mimic后甘油三酯測定
        2.4 轉染miR-141 mimic后油紅O染色
    3 討論
    4 小結
第三章 bta-miR-141靶向SIRT1調控奶牛乳腺上皮細胞乳脂代謝
    1 試驗準備
        1.1 試驗試劑與儀器
        1.2 試驗細胞
    2 試驗方法
        2.1 雙熒光素酶報告基因驗證miRNA對SIRT1基因的靶向作用
            2.1.1 牛SIRT1基因野生型重組質粒構建
            2.1.2 SIRT1基因3'UTR區(qū)片段的擴增及純化
            2.1.3 PCR產(chǎn)物的雙酶切、回收純化與連接
            2.1.4 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備、連接和轉化
            2.1.5 重組質粒的測序鑒定
            2.1.6 牛SIRT1基因突變載體的構建
            2.1.7 雙熒光素酶報告基因活性檢測試驗
        2.2 熒光定量PCR反應
        2.3 Western Blot驗證miRNA對SIRT1基因的靶向作用
            2.3.1 蛋白樣品制備
            2.3.2 蛋白定量試驗(BCA試驗)
            2.3.3 SDS-PAGE電泳
            2.3.4 轉膜
            2.3.5 免疫雜交封閉
            2.3.6 顯色與Western Blot圖像分析
        2.4 SIRT1基因的功能研究
            2.4.1 靶向干擾SIRT1基因的siRNA序列的設計及合成
            2.4.2 siRNA敲降SIRT1效率驗證
            2.4.3 siRNA與miR-141 mimic共轉染對乳脂代謝相關基因表達量的影響
        2.5 統(tǒng)計分析
    3 研究結果
        3.1 雙熒光素酶報告基因結果顯示miR-141對SIRT1基因的靶向作用
            3.1.1 菌落PCR產(chǎn)物電泳結果
            3.1.2 陽性克隆測序結果
            3.1.3 野生型載體突變
            3.1.4 miR-141與SIRT1 3'UTR區(qū)靶位點雙熒光素酶報告基因的檢測結果
        3.2 過表達/抑制表達miR-141影響SIRT1基因及乳脂代謝相關基因的表達
        3.3 過表達miR-141影響SIRT1蛋白表達
        3.4 SIRT1基因的功能研究
            3.4.1 siRNA敲降SIRT1效率驗證
            3.4.2 siSIRT1與miR-141 mimic共轉染對乳脂代謝相關基因表達量的影響
    4 討論
    5 小結
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文



本文編號：3793045