奶牛乳腺乳脂代謝受到諸多因素的調(diào)控,是十分復(fù)雜的過程。SIRT1基因是具有乙�；饔玫某聊畔⒄{(diào)控子。SIRT1基因在脂肪細(xì)胞中高表達(dá),在部分哺乳動(dòng)物體內(nèi)起到抑制脂肪生成的作用。目前關(guān)于SIRT1基因在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中對(duì)乳脂代謝調(diào)控作用的研究報(bào)道較少。MicroRNA(miRNA)是一類轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的非編碼RNA,其可以通過調(diào)控靶基因的表達(dá)而間接地影響乳脂代謝過程。本實(shí)驗(yàn)室前期利用高通量測序技術(shù)分別對(duì)泌乳前7天和泌乳180天奶牛乳腺組織中miRNA的表達(dá)模式進(jìn)行鑒定,分析得到bta-miR-141顯著差異表達(dá)(P<0.05)。生物信息學(xué)分析表明,bta-miR-141靶向調(diào)控SIRT1基因。本研究以奶牛乳腺上皮細(xì)胞及人腎上皮細(xì)胞系(293T)為研究對(duì)象,運(yùn)用甘油三酯含量測定、油紅O染色、熒光定量PCR(qRT-PCR)、雙熒光素酶報(bào)告基因以及免疫印跡等試驗(yàn)技術(shù),研究bta-miR-141靶向SIRT1基因調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂代謝的機(jī)制。所得結(jié)果如下:1、bta-miR-141功能探究:奶牛乳腺上皮細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-141模擬物(mimic)、陰性對(duì)照(mimic-NC)。...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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中文摘要
Abstract
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第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 乳脂肪概述
        1.1 乳脂肪合成途徑
        1.2 乳脂肪合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展
    2 Sirtuin家族及SIRT1基因的研究進(jìn)展
        2.1 Sirtuin家族基因的結(jié)構(gòu)特征
        2.2 Sirtuin家族基因的功能概述
        2.3 Sirtuin家族基因?qū)M織、器官以及個(gè)體發(fā)育的影響
        2.4 Sirtuin家族成員的應(yīng)用及發(fā)展方向
        2.5 去乙酰化酶SIRT1的結(jié)構(gòu)、表達(dá)與定位
        2.6 SIRT1基因與脂代謝
        2.7 SIRT1 -SREBP-1c通路
        2.8 SIRT1 -PGC-1α通路
    3 microRNA與乳脂代謝
        3.1 microRNA的生物合成
        3.2 microRNA的作用機(jī)制
        3.3 microRNA的調(diào)控功能研究
        3.4 microRNA在動(dòng)物脂肪組織及乳腺組織中的研究
        3.5 microRNA的靶基因預(yù)測與驗(yàn)證
        3.6 miR-141的研究進(jìn)展
    4 研究的目的、研究思路及技術(shù)路線
        4.1 研究的目的與意義
        4.2 研究思路
        4.3 技術(shù)路線
第二章 bta-miR-141在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的功能探究
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)試劑與配置、儀器
        1.2 試驗(yàn)細(xì)胞
        1.3 引物
        1.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)
            1.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇
            1.4.2 細(xì)胞傳代
            1.4.3 細(xì)胞凍存
        1.5 差異表達(dá)miRNA的生物信息學(xué)篩選
        1.6 bta-miR-141在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染
        1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)
            1.7.1 細(xì)胞總RNA的提取
            1.7.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA質(zhì)量
            1.7.3 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA
            1.7.4 miRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA
            1.7.5 Real-time PCR
        1.8 甘油三酯測定
        1.9 油紅O染色
        1.10 統(tǒng)計(jì)分析
    2 結(jié)果
        2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)
        2.2 qRT-PCR檢測牛乳腺上皮細(xì)胞中miR-141的過表達(dá)和抑制表達(dá)效果
        2.3 轉(zhuǎn)染miR-141 mimic后甘油三酯測定
        2.4 轉(zhuǎn)染miR-141 mimic后油紅O染色
    3 討論
    4 小結(jié)
第三章 bta-miR-141靶向SIRT1調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂代謝
    1 試驗(yàn)準(zhǔn)備
        1.1 試驗(yàn)試劑與儀器
        1.2 試驗(yàn)細(xì)胞
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miRNA對(duì)SIRT1基因的靶向作用
            2.1.1 牛SIRT1基因野生型重組質(zhì)粒構(gòu)建
            2.1.2 SIRT1基因3'UTR區(qū)片段的擴(kuò)增及純化
            2.1.3 PCR產(chǎn)物的雙酶切、回收純化與連接
            2.1.4 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接和轉(zhuǎn)化
            2.1.5 重組質(zhì)粒的測序鑒定
            2.1.6 牛SIRT1基因突變載體的構(gòu)建
            2.1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測試驗(yàn)
        2.2 熒光定量PCR反應(yīng)
        2.3 Western Blot驗(yàn)證miRNA對(duì)SIRT1基因的靶向作用
            2.3.1 蛋白樣品制備
            2.3.2 蛋白定量試驗(yàn)(BCA試驗(yàn))
            2.3.3 SDS-PAGE電泳
            2.3.4 轉(zhuǎn)膜
            2.3.5 免疫雜交封閉
            2.3.6 顯色與Western Blot圖像分析
        2.4 SIRT1基因的功能研究
            2.4.1 靶向干擾SIRT1基因的siRNA序列的設(shè)計(jì)及合成
            2.4.2 siRNA敲降SIRT1效率驗(yàn)證
            2.4.3 siRNA與miR-141 mimic共轉(zhuǎn)染對(duì)乳脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響
        2.5 統(tǒng)計(jì)分析
    3 研究結(jié)果
        3.1 雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示miR-141對(duì)SIRT1基因的靶向作用
            3.1.1 菌落PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果
            3.1.2 陽性克隆測序結(jié)果
            3.1.3 野生型載體突變
            3.1.4 miR-141與SIRT1 3'UTR區(qū)靶位點(diǎn)雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測結(jié)果
        3.2 過表達(dá)/抑制表達(dá)miR-141影響SIRT1基因及乳脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)
        3.3 過表達(dá)miR-141影響SIRT1蛋白表達(dá)
        3.4 SIRT1基因的功能研究
            3.4.1 siRNA敲降SIRT1效率驗(yàn)證
            3.4.2 siSIRT1與miR-141 mimic共轉(zhuǎn)染對(duì)乳脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響
    4 討論
    5 小結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3793045