副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)是屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬的成員,為革蘭氏陰性菌,是革拉澤氏病(Glaesser’s Disease)的主要病原菌。研究表明HPS常在與豬繁殖與呼吸綜合癥病毒等病的病原混合感染時對機體造成免疫抑制,從而加重感染發(fā)病,給養(yǎng)豬業(yè)帶來重大的經濟損失,嚴重威脅到養(yǎng)豬產業(yè)的健康發(fā)展。脂蛋白PalA作為HPS的重要毒力因子之一,是細胞膜脂蛋白與肽聚糖相互作用結合的一類蛋白,廣泛的存在于革蘭氏陰性細菌中,可作為疫苗的候選蛋白。本研究以三株副豬嗜血桿菌四川分離株為材料,進行PalA基因PCR擴增,構建該基因的克隆載體及5型菌株PalA基因的表達載體并進行生物信息學分析。 Ⅰ、副豬嗜血桿菌的分離鑒定 對來自四川省遂寧市�；B(yǎng)殖場中疑似副豬嗜血桿菌(HPS)感染的發(fā)病豬的肺臟等病料組織,做無菌處理后,劃線方式涂布于TSA培養(yǎng)基,挑取菌落形態(tài)特征與副豬嗜血桿菌相似的單個菌落接種TSA培養(yǎng)基,經三次傳代純化后進行形態(tài)學鑒定、染色鏡檢及培養(yǎng)特性檢測、生化試驗、血清型試驗等基本生物學特性研究。 Ⅱ、PalA基因的克隆與序列分析 參照GenBank收錄...

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【學位級別】：碩士

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摘要
Abstract
1. 文獻綜述
    1.1. 副豬嗜血桿菌研究進展
        1.1.1. 病原學和血清學研究進展
        1.1.2. 基因分型研究
        1.1.3. 細菌分離鑒定與培養(yǎng)
        1.1.4. 致病機理
        1.1.5. 副豬嗜血桿菌毒力因子的研究
        1.1.6. 臨床用藥的研究
        1.1.7. 預防和免疫
    1.2. 生物信息學在病原研究中的應用
    1.3. 課題研究的目的和意義
2. 材料和設備
    2.1. 試驗材料
        2.1.1. 病料
        2.1.2. 試驗所涉及的菌株和質粒
        2.1.3. 試驗所涉及的酶，試劑盒及生化試劑
    2.2. 主要儀器設備
    2.3. 分析軟件及網站
3. 實驗方法
    3.1. 副豬嗜血桿菌的分離鑒定
        3.1.1. 培養(yǎng)基的制備
        3.1.2. 細菌的分離培養(yǎng)
        3.1.3. NAD依賴性試驗
        3.1.4. CAMP試驗
        3.1.5. 生化試驗
        3.1.6. 血清型鑒定
    3.2. PalA基因的克隆
        3.2.1. PalA基因的引物設計與合成
        3.2.2. PaLA基因的PCR擴增
        3.2.3. PaLA基因PCR擴增產物膠回收
        3.2.4. PCR純化產物與pMD19-T Vector連接
        3.2.5. DH5α感受態(tài)細胞的制備(CaCl₂法)
        3.2.6. 連接產物的轉化
        3.2.7. 重組質粒提取
        3.2.8. 重組質粒測序
        3.2.9. 重組質粒的雙酶切
    3.3. pET32a-PalA表達載體的構建
        3.3.1. 表達載體pET32a進行雙酶切
        3.3.2. 目的片段與載體片段的連接
        3.3.3. 載體質粒的修復轉化到DH5α及陽性菌株的篩選
        3.3.4. 表達載體質粒的提取
        3.3.5. 重組質粒測序
        3.3.6. BL21感受態(tài)細胞的制備(CaCl₂法)
        3.3.7. 重組表達載體的轉化
        3.3.8. 陽性檢測
    3.4. 生物信息學分析
        3.4.1. ORF的查找分析
        3.4.2. 蛋白質理化性質分析
        3.4.3. 蛋白質的疏水性分析
        3.4.4. 蛋白質跨膜區(qū)分析
        3.4.5. 蛋白質的主要抗原域預測
        3.4.6. 蛋白質的表面可能性預測
        3.4.7. 蛋白質的信號肽預測
        3.4.8. 氨基酸二級結構的預測
        3.4.9. 蛋白質三維結構預測
        3.4.10. 序列同源性和相似性搜索
        3.4.11. 多序列比對和系統(tǒng)進化樹的建立
4. 結果與分析
    4.1. 副豬嗜血桿菌的分離鑒定
        4.1.1. 細菌的分離培養(yǎng)特性
        4.1.2. 細菌的鑒定結果
        4.1.3. 血清型鑒定
    4.2. HPS四川分離株PaLA基因的克隆
        4.2.1. PaLA基因的PCR擴增
        4.2.2. pMD19-T-PalA克隆載體的獲得
    4.3. pET32a-PalA表達載體的構建
        4.3.1. 重組表達載體pET32a-PalA的獲得
        4.3.2. 表達菌株BL21(pET32a-PalA)的獲得
    4.4. HPS-PalA生物信息學分析
        4.4.1. HPS-PalA基因編碼氨基酸序列基本理化性質的分析
        4.4.2. HPS-PalA基因編碼蛋白質的疏水性分析
        4.4.3. 跨膜區(qū)分析
        4.4.4. PalA基因編碼蛋白質的主要抗原域預測
        4.4.5. HPS-PalA基因編碼蛋白質的表面可能性預測
        4.4.6. HPS-PalA基因編碼蛋白信號肽預測
        4.4.7. HPS-PalA基因編碼蛋白質的二級結構預測
        4.4.8. 蛋白質三維結構預測
        4.4.9. 進化樹分析
5. 討論
    5.1. 副豬嗜血桿菌的分離鑒定
    5.2. PaLA基因的PCR擴增及克隆
    5.3. pET32a-PalA表達載體的構建
    5.4. PaLA基因的生物信息學分析
6. 結論
參考文獻
致謝



本文編號：3791441