嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體是經(jīng)蜱傳播的專性的革蘭氏陰性小球桿菌，還是重要的人獸共患病病原體，不僅可以感染人，也可以感染牛羊反芻動(dòng)物，及馬和狗等家養(yǎng)動(dòng)物。自20世紀(jì)90年代初于美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，澳洲、歐洲多國(guó)、韓國(guó)及我國(guó)先后均有報(bào)道，且近年來(lái)呈上升趨勢(shì)。由于該病的臨床多表現(xiàn)為急性不明原因發(fā)熱，肌肉痛，乏力，頭痛等類似病毒感染性疾病癥狀，臨床缺乏對(duì)該病的足夠認(rèn)識(shí)，也缺乏相應(yīng)的快速診斷方法，因此該病及易發(fā)生誤診，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致多器官功能衰竭，甚至死亡，所以對(duì)該病的確診就要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行診斷，目前應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有IFA、急性期的血液涂片檢查、巢氏PCR、直接對(duì)病原的分離培養(yǎng)。但是免疫熒光方法（IFA）不僅需要特殊儀器如熒光顯微鏡，還需要等到恢復(fù)期采集第二次血液標(biāo)本。病原體分離培養(yǎng)診斷十分可靠，但分離率低且耗時(shí)。以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)可以取代分離培養(yǎng)進(jìn)行病原體檢測(cè)，但需要特殊的儀器及具備一定實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)的人員才能完成。因此開發(fā)一種簡(jiǎn)便的靈敏性的高特異性的檢測(cè)方法對(duì)于該病原體的診斷是很有必要的。 嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的OMP1/MSP2/P44蛋白超家族是無(wú)形體的特征性的蛋白家族，該家族基因包...

【文章頁(yè)數(shù)】：93 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
英文縮略詞表
第一篇 綜述
    1 病原分類學(xué)
    2 病原及基因組特點(diǎn)
    3 嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的入侵機(jī)制
    4 傳播媒介及宿主動(dòng)物
    5 流行病學(xué)
    6 臨床癥狀及治療
    7 診斷和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
        7.1 臨床癥狀
        7.2 直接鑒定
        7.3 PCR檢測(cè)和病原分離培養(yǎng)
        7.4 血清學(xué)診斷
        7.5 病理學(xué)診斷
    8 P44/msp2蛋白
第二篇 實(shí)驗(yàn)研究
    實(shí)驗(yàn)一 msp2、msp4蛋白全長(zhǎng)中信號(hào)肽對(duì)原核表達(dá)的影響
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 序列來(lái)源及菌株
                1.1.2 主要儀器設(shè)備
            1.2 方法
                1.2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
                1.2.2 陽(yáng)性表達(dá)菌BL21（DE3）鑒定
                1.2.3 陽(yáng)性表達(dá)菌的誘導(dǎo)表達(dá)
            1.3 pET28a表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)菌的誘導(dǎo)
                1.3.1 三個(gè)重組的pET32a質(zhì)粒與pET28a（+）空載體酶切
                1.3.2 目的片段與pET-28a大片段連接
                1.3.3 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化表達(dá)菌BL21（DE3）
                1.3.4 pET28a陽(yáng)性重組表達(dá)菌的鑒定
                1.3.5 陽(yáng)性表達(dá)菌的誘導(dǎo)表達(dá)
            1.4 pGEX-4T-1表達(dá)載體的構(gòu)建和表達(dá)菌的誘導(dǎo)
            1.5 E-msp2、N-msp4、Z-msp4的信號(hào)肽分析
        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
            2.1 合成的三個(gè)表面蛋白全長(zhǎng)基因的pET32a載體酶切鑒定
            2.2 重組質(zhì)粒pET32a（+）誘導(dǎo)表達(dá)情況
            2.3 重組質(zhì)粒pET28a（+）表達(dá)載體的酶切鑒定
            2.4 重組質(zhì)粒pET28a（+）誘導(dǎo)表達(dá)情況
            2.5 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1表達(dá)載體的酶切鑒定
            2.6 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1誘導(dǎo)表達(dá)情況
            2.7 信號(hào)肽分析結(jié)果
        3 討論
            3.1 信號(hào)肽對(duì)原核蛋白表達(dá)的影響
            3.2 跨膜區(qū)對(duì)原核蛋白表達(dá)的影響
            3.3 稀有密碼子對(duì)原核蛋白表達(dá)的影響
    實(shí)驗(yàn)二 嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體msp2、msp4蛋白的生物信息學(xué)分析及表達(dá)純化
        摘要
        1 方法和材料
            1.1 材料
                1.1.1 菌株和試劑
                1.1.2 主要儀器設(shè)備
            1.2 實(shí)驗(yàn)方法
                1.2.1 msp2、msp4蛋白的生物信息學(xué)分析
                1.2.2 引物設(shè)計(jì)
                1.2.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建
                1.2.4 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
                1.2.5 重組蛋白的表達(dá)形式分析
                1.2.6 重組蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化
                1.2.7 Western-blot分析
                1.2.8 重組蛋白的純化
                1.2.9 純化后的重組蛋白的濃度測(cè)定（BCA法）
        2 結(jié)果
            2.1 msp2、msp4蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果
                2.1.1 ProtParam工具分析結(jié)果
                2.1.2 SOPMA預(yù)測(cè)msp2、msp4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)
                2.1.3 msp2、msp4蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果
                2.1.4 msp2、msp4蛋白的親水性預(yù)測(cè)結(jié)果
                2.1.5 msp2、msp4蛋白的抗原表位分析
            2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.3 小量蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
            2.4 重組蛋白的表達(dá)形式分析
            2.5 蛋白的誘導(dǎo)條件的優(yōu)化
                2.5.1 不同濃度下IPTG對(duì)蛋白表達(dá)的影響
                2.5.2 低溫條件下對(duì)蛋白的表達(dá)形式的影響
            2.6 蛋白的純化
            2.7 WesternBlot
        3 討論
    實(shí)驗(yàn)三 重組msp2、msp4蛋白的免疫原性研究
        摘要
        1 材料和方法
            1.1 材料
                1.1.1 主要試劑
                1.1.2 主要血清
                1.1.3 主要儀器
                1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
                1.1.5 主要試劑的配制
            1.2 方法
                1.2.1 重組蛋白的多抗的制備
                1.2.2 小鼠抗體水平的測(cè)定-ELISA
                1.2.3 間接ELISA最佳工作條件的的確定
        2 結(jié)果
            2.1 小鼠抗體水平的測(cè)定
            2.2 ELISA工作條件的確定
                2.2.1 抗原包被的最佳濃度和待檢血清最佳稀釋倍數(shù)的確定
                2.2.2 最適封閉液的和封閉時(shí)間的確定
                2.2.3 酶標(biāo)二抗最佳工作濃度的確定
                2.2.5 底物作用時(shí)間的確定
                2.2.6 cut-off值的確定
                2.2.7 特異性試驗(yàn)
                2.2.8 靈敏性試驗(yàn)
                2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn)
                2.2.10 臨床樣品檢測(cè)
        3 討論
第三篇 實(shí)驗(yàn)結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附件
致謝
作者簡(jiǎn)介及在研究生期間主要參與的研究項(xiàng)目、發(fā)表文章
石河子大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文導(dǎo)師評(píng)閱表



本文編號(hào)：3789568