傳染性法氏囊病病毒(IBDV)屬于雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬,主要侵害3-6周齡的雛雞,發(fā)病后導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制,目前對(duì)該病引起的免疫抑制機(jī)理依然不甚明了。本研究利用IBDV體外感染模型,系統(tǒng)研究了IBDV基因組dsRNA及其編碼的病毒蛋白與宿主干擾素系統(tǒng)間的相互影響,旨在為深入研究IBDV的免疫抑制機(jī)制和尋找潛在藥物治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。Ⅰ型干擾素是宿主抵抗病毒感染的第一道防線,模式識(shí)別受體RLR和TLR是抗病毒先天免疫反應(yīng)過(guò)程中介導(dǎo)Ⅰ型干擾素表達(dá)的主要途徑。雞Ⅰ型干擾素是最先被發(fā)現(xiàn)和命名的,但對(duì)于雞抗病毒先天免疫過(guò)程中干擾素的誘生過(guò)程依然不是很清楚。本研究首先克隆了雞MAVS基因,通過(guò)與哺乳動(dòng)物MAVS比較,發(fā)現(xiàn)雞MAVS具有與哺乳動(dòng)物MAVS相同的結(jié)構(gòu)域組成及亞細(xì)胞定位關(guān)系。功能分析發(fā)現(xiàn),雞MAVS與胞內(nèi)dsRNA誘導(dǎo)雞IFN-p的表達(dá)密切相關(guān)。通過(guò)構(gòu)建雞MAVS和轉(zhuǎn)錄因子IRF3共表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),在過(guò)表達(dá)雞MAVS上調(diào)雞IFN-β表達(dá)的過(guò)程中,IRF3并不發(fā)生入核,表明雞MAVS與胞內(nèi)dsRNA誘導(dǎo)雞IFN-p的表達(dá)相關(guān),但在此過(guò)程中不涉及轉(zhuǎn)錄因子IRF3的入核。體內(nèi)研...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
論文創(chuàng)新點(diǎn)
摘要
ABSTRACT
研究意義
技術(shù)路線
第一部分 文獻(xiàn)綜述
    第一章 病毒感染與宿主抗病毒免疫研究進(jìn)展
        1 先天免疫在抗病毒反應(yīng)過(guò)程中的作用
            1.1 干擾素抗病毒作用的機(jī)制
            1.2 病毒感染誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生IFN-α/β的過(guò)程
                1.2.1 RLR通路
                1.2.2 TLR通路
            1.3 宿主對(duì)RLR通路介導(dǎo)IFN-β表達(dá)的調(diào)控機(jī)制
                1.3.1 泛素化修飾對(duì)于RLR抗病毒信號(hào)的調(diào)控
                1.3.2 去泛素化酶對(duì)RLR抗病毒信號(hào)的調(diào)控
                1.3.3 磷酸化修飾對(duì)于RLR抗病毒信號(hào)的調(diào)控
                1.3.4 Ⅰ型干擾素的正反饋調(diào)節(jié)作用
        2 病毒逃逸先天免疫抗病毒反應(yīng)的策略
            2.1 病毒抑制誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生的信號(hào)
            2.2 病毒廣泛抑制宿主蛋白的表達(dá)
            2.3 病毒抑制IFN下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)
            2.4 病毒抑制IFN誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗病毒蛋白活性
            2.5 病毒蛋白劫持宿主泛素系統(tǒng)的功能
        3 禽類(lèi)抗病毒免疫相關(guān)模式識(shí)別受體
            3.1 禽類(lèi)TLR3、7、15、21
            3.2 禽類(lèi)RLRs
    第二章 IBDV致病機(jī)制的研究進(jìn)展
        1 IBDV簡(jiǎn)介
            1.1 IBDV的基因組特點(diǎn)
            1.2 IBDV編碼的蛋白
                1.2.1 VP1蛋白
                1.2.2 VP2蛋白
                1.2.3 VP3蛋白
                1.2.4 VP4蛋白
                1.2.5 VP5蛋白
        2 IBDV侵入宿主細(xì)胞的機(jī)制
            2.1 病毒侵入宿主的方式
            2.2 IBDV的細(xì)胞受體
                2.2.1 雞B淋巴細(xì)胞受體
                2.2.2 成纖維細(xì)胞受體
                2.2.3 其他細(xì)胞受體
        3 IBD導(dǎo)致免疫抑制的機(jī)制
第二部分 研究?jī)?nèi)容
    第一章 雞MAVS的克隆及功能分析
        摘要
        1 材料
            1.1 主要儀器與器材
            1.2 試劑、細(xì)胞、毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2 方法
            2.1 雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)的制備
            2.2 總RNA的抽提和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
            2.3 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.4 轉(zhuǎn)化
            2.5 DNA片段的回收
            2.6 T-A克隆和序列測(cè)定
            2.7 半定量RT-PCR及光密度分析
            2.8 生物信息學(xué)軟件對(duì)雞MAVS結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)
            2.9 雞MAVS真核表達(dá)載體及結(jié)構(gòu)域缺失突變體的構(gòu)建
            2.10 共表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.11 SDS-PAGE及Western blot分析
            2.12 質(zhì)粒抽提
            2.13 RNA干擾
            2.14 轉(zhuǎn)染與激光共聚焦觀察
            2.15 間接免疫熒光(IFA)
            2.16 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)
            2.17 胞內(nèi)Poly(I：C)刺激和熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)
            2.18 病毒滴度的測(cè)定
            2.19 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        3 結(jié)果
            3.1 雞MAVS的克隆、序列測(cè)定和生物信息學(xué)分析
            3.2 雞MAVS與其他物種MAVS的同源性及進(jìn)化分析
            3.3 chMAVS的亞細(xì)胞定位
            3.4 chMAVS在chIFN-β誘生過(guò)程中的作用
            3.5 chMAVS各結(jié)構(gòu)域?qū)hIFN-β表達(dá)的影響
            3.6 chMAVS介導(dǎo)chIFN-β的誘生不需要IRF3的入核
            3.7 chMAVS具有抗IBDV的功能
        4 討論
    第二章 IBDV感染對(duì)宿主細(xì)胞·型干擾素系統(tǒng)的影響
        摘要
        1 材料
            1.1 主要儀器與器材
            1.2 試劑、細(xì)胞、毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2 方法
            2.1 IBDV病毒的擴(kuò)大培養(yǎng)與病毒基因組dsRNA的抽提
            2.2 IBDV熱滅活條件的摸索
            2.3 胞內(nèi)dsRNA刺激實(shí)驗(yàn)
            2.4 雞IFN-α/β預(yù)處理DF-1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
            2.5 SDS-PAGE和Western-blot分析
            2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)
            2.7 雞MDA5基因的克隆、生物信息學(xué)分析及相關(guān)表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.8 IBDV基因組dsRNA的生物素標(biāo)記
            2.9 dsRNA pulldown實(shí)驗(yàn)
            2.10 RNA干擾
            2.11 病毒滴度的測(cè)定
            2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        3 結(jié)果
            3.1 雞Ⅰ型干擾素預(yù)處理DF-1細(xì)胞后顯著抑制IBDV的胞內(nèi)復(fù)制
            3.2 IBDV感染不能誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞上調(diào)表達(dá)Ⅰ型干擾素
            3.3 IBDV病毒蛋白與雞MAVS不存在共定位
            3.4 chIFN-α/β預(yù)處理增強(qiáng)IBDV感染DF-1細(xì)胞后chIFN-β的表達(dá)
            3.5 IBDV基因組dsRNA是一種PAMP
            3.6 雞MDA5的克隆及有效shRNA的篩選和穩(wěn)定干擾細(xì)胞的建立
            3.7 雞胞內(nèi)模式識(shí)別受體MDA5介導(dǎo)DF-1細(xì)胞對(duì)IBDV基因組dsRNA的識(shí)別
        4 討論
    第三章 VP3阻斷宿主細(xì)胞干擾素-β表達(dá)的機(jī)制研究
        摘要
        1 材料
            1.1 主要儀器與器材
            1.2 試劑、細(xì)胞、毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2 方法
            2.1 IFA
            2.2 半定量RT-PCR
            2.3 SDS-PAGE和Western-blot分析
            2.4 病毒蛋白誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建
            2.5 pCMV-Flag-VP1～5及VP3突變載體的構(gòu)建
            2.6 VP3和VP4的原核表達(dá)
            2.7 IBDV基因組dsRNA的抽提及其生物素標(biāo)記
            2.8 VP3和chMDA5競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IBDV基因組dsRNA實(shí)驗(yàn)
            2.9 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)
            2.10 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
            2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
        3 結(jié)果
            3.1 篩選阻斷dsRNA誘導(dǎo)chIFN-β表達(dá)的IBDV病毒蛋白
            3.2 構(gòu)建病毒蛋白VP1～5的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)
            3.3 過(guò)表達(dá)VPs對(duì)胞內(nèi)dsRNA刺激上調(diào)chIFN-β表達(dá)的影響
            3.4 VP3可結(jié)合dsRNA
            3.5 K₉₉R₁₀₂K₁₀₅K₁₀₆共同負(fù)責(zé)VP3結(jié)合dsRNA的功能
            3.6 VP3阻斷胞內(nèi)dsRNA誘導(dǎo)的chIFN-β上調(diào)表達(dá)與其dsRNA結(jié)合能力有關(guān)
            3.7 VP3與chMDA5競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合IBDV基因組dsRNA
            3.8 VP3和chMDA5不存在相互作用
        4 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
第三部分 附錄
    附錄A 全文縮略語(yǔ)
    附錄B 常用緩沖液及培養(yǎng)基配方
    附錄C 攻讀博士期間學(xué)術(shù)成果
致謝



本文編號(hào)：3781377