旨在構建干擾胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-Ⅱ, IGF-Ⅱ)的重組質粒載體,研究IGF-Ⅱ對牦牛睪丸支持細胞的影響。本研究設計并合成針對牦牛IGF-Ⅱ的shRNA寡核苷酸,并將其克隆至pLKO.1質粒載體上,轉染牦牛睪丸支持細胞后經嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定的細胞株,并采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印跡法檢測IGF-Ⅱ基因和蛋白的表達,采用細胞生長分析儀分析支持細胞的增殖凋亡情況。結果顯示,干擾牦牛IGF-Ⅱ表達的pLKO.1質粒載體構建成功,其可在睪丸支持細胞中穩(wěn)定表達,且能有效抑制IGF-Ⅱ基因的表達。與對照組相比,pLKO.1-shRNA2的干擾效率最顯著,IGF-Ⅱ的表達量下調至19.1%(P<0.05),且pLKO.1-shRNA2可使內源性IGF-Ⅱ蛋白的表達量減少76.3%(P<0.05)。pLKO.1-shRNA2質粒轉染及篩選得到的穩(wěn)定細胞株培養(yǎng)48 h后的細胞分裂增殖活性顯著低于對照組(P<0.05)。qRT-PCR結果顯示,干擾內源性IGF-Ⅱ后,睪丸支持細胞中的IGF-Ⅰ和IGF-ⅡR基因...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 主要儀器與試劑
    1.2 牦牛支持細胞的分離與培養(yǎng)
    1.3 pLKO.1-shRNA-IGF-II載體的構建
    1.4 牦牛睪丸支持細胞的轉染
    1.5 qRT-PCR檢測干擾效率
    1.6 Western blotting檢測IGF-II蛋白的表達
    1.7 細胞生長檢測
    1.8 數據統(tǒng)計與分析
2 結 果
    2.1 pLKO.1-shRNA-IGF-II載體的構建及鑒定
    2.2 qRT-PCR檢測干擾效率
    2.3 Western blotting檢測IGF-II蛋白表達
    2.4 牦牛睪丸支持細胞生長檢測
    2.5 干擾IGF-II對支持細胞內IGFs等相關基因的影響
3 討 論
4 結 論



本文編號：3780979