旨在構(gòu)建干擾胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-Ⅱ, IGF-Ⅱ)的重組質(zhì)粒載體,研究IGF-Ⅱ?qū)﹃笈２G丸支持細(xì)胞的影響。本研究設(shè)計(jì)并合成針對牦牛IGF-Ⅱ的shRNA寡核苷酸,并將其克隆至pLKO.1質(zhì)粒載體上,轉(zhuǎn)染牦牛睪丸支持細(xì)胞后經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株,并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印跡法檢測IGF-Ⅱ基因和蛋白的表達(dá),采用細(xì)胞生長分析儀分析支持細(xì)胞的增殖凋亡情況。結(jié)果顯示,干擾牦牛IGF-Ⅱ表達(dá)的pLKO.1質(zhì)粒載體構(gòu)建成功,其可在睪丸支持細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),且能有效抑制IGF-Ⅱ基因的表達(dá)。與對照組相比,pLKO.1-shRNA2的干擾效率最顯著,IGF-Ⅱ的表達(dá)量下調(diào)至19.1%(P<0.05),且pLKO.1-shRNA2可使內(nèi)源性IGF-Ⅱ蛋白的表達(dá)量減少76.3%(P<0.05)。pLKO.1-shRNA2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及篩選得到的穩(wěn)定細(xì)胞株培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞分裂增殖活性顯著低于對照組(P<0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示,干擾內(nèi)源性IGF-Ⅱ后,睪丸支持細(xì)胞中的IGF-Ⅰ和IGF-ⅡR基因...

【文章頁數(shù)】：9 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 主要儀器與試劑
    1.2 牦牛支持細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
    1.3 pLKO.1-shRNA-IGF-II載體的構(gòu)建
    1.4 牦牛睪丸支持細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
    1.5 qRT-PCR檢測干擾效率
    1.6 Western blotting檢測IGF-II蛋白的表達(dá)
    1.7 細(xì)胞生長檢測
    1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
2 結(jié) 果
    2.1 pLKO.1-shRNA-IGF-II載體的構(gòu)建及鑒定
    2.2 qRT-PCR檢測干擾效率
    2.3 Western blotting檢測IGF-II蛋白表達(dá)
    2.4 牦牛睪丸支持細(xì)胞生長檢測
    2.5 干擾IGF-II對支持細(xì)胞內(nèi)IGFs等相關(guān)基因的影響
3 討 論
4 結(jié) 論



本文編號：3780979