本文以CSFV蛋白在宿主細胞中表達為研究基礎(chǔ),分別研究：各蛋白在感染細胞中表達情況；在細胞中各蛋白真核表達情況；在細胞中真核表達的各蛋白對宿主細胞的影響；以及在細胞中真核表達的各蛋白對病毒感染的影響。 為研究豬瘟病毒蛋白在感染細胞中表達情況,將原核表達的各個CSFV蛋白純化后分別免疫昆明小鼠制備多克隆抗體血清。結(jié)果獲得除P7蛋白外11個重組CSFV蛋白并制備獲得高滴度抗體的免疫血清。Western-Blotting能檢測到病毒各蛋白片段與預期大小的一致,其中E0、E1、E2和NS5A還以蛋白聚合體形式存在。間接免疫熒光分析(Indirect Immuno-fluorescence Assay IFA)檢測顯示Npro主要定位于細胞核；C、E0和NS2在細胞核亦有分布,但主要是位于細胞質(zhì)中；其他蛋白則位于細胞質(zhì)中；E0蛋白還在細胞膜表面有分布。結(jié)果分析表明,分布于細胞核上的CSFV蛋白可能對細胞有調(diào)控作用,而分布于細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白則主要參與病毒復制、組裝和增殖。 將CSFV C株各蛋白基因以pEGFP-N1為載體構(gòu)建成真核表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染ST細胞來研究各蛋白在細胞中真核表達情況。PCR檢測結(jié)...

【文章頁數(shù)】：115 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1 CSFV分子生物學特性
    2 CSFV感染宿主細胞的途徑和機制
    3 CSFV感染免疫抑制機理
    4 CSFV感染致組織病變及機理
    5 CSFV在感染細胞中復制增殖機制
    6 結(jié)構(gòu)蛋白在CSFV感染中的作用
    7 非結(jié)構(gòu)蛋白在CSFV感染細胞中的作用
    8 展望及本研究目的
第二章 CSFV蛋白在感染細胞中表達情況的研究
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 質(zhì)粒、菌株、細胞和實驗動物
            1.1.2 引物設(shè)計與合成
            1.1.3 主要試劑和耗材
        1.2 方法
            1.2.1 CSFV蛋白原核表達載體的構(gòu)建
            1.2.2 CSFV蛋白原核表達與鑒定
            1.2.3 蛋白純化
            1.2.4 多克隆抗體制備
            1.2.5 Western blotting檢測CSFV感染細胞中病毒蛋白
            1.2.6 IFA鑒定CSFV感染細胞中病毒蛋白
    2 結(jié)果
        2.1 CSFV蛋白原核表達載體的構(gòu)建
        2.2 CSFV蛋白原核表達、鑒定及純化
        2.3 ELISA檢測CSFV蛋白免疫小鼠血清抗體
        2.4 Western blotting檢測CSFV感染細胞中病毒蛋白
        2.5 IFA鑒定CSFV感染細胞中病毒蛋白
    3 分析與討論
    4 小結(jié)
第三章 CSFV蛋白真核表達研究及穩(wěn)定表達細胞系的建立
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 質(zhì)粒、大腸桿菌感受態(tài)細胞、病毒和ST細胞
            1.1.2 引物設(shè)計與合成
            1.1.3 主要試劑和耗材
        1.2 方法
            1.2.1 CSFV蛋白真核表達載體的構(gòu)建
            1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染及篩選
            1.2.3轉(zhuǎn)染細胞檢測
            1.2.4 細胞克隆及穩(wěn)定表達細胞系建立
            1.2.5 細胞系穩(wěn)定性及細胞增殖情況測定
            1.2.6 細胞周期測定
    2 結(jié)果
        2.1 CSFV蛋白真核表達載體的構(gòu)建
        2.2 細胞轉(zhuǎn)染及篩選
        2.3 轉(zhuǎn)染細胞中目的蛋白基因檢測
        2.4 轉(zhuǎn)染細胞中熒光觀察
            2.4.1 熒光信號強弱
            2.4.2 熒光信號分布
        2.5 細胞克隆及穩(wěn)定表達細胞系的鑒定
        2.6 細胞系穩(wěn)定性及增殖情況測定
        2.7 細胞周期測定
    3 分析與討論
    4 小結(jié)
第四章 各CSFV蛋白真核表達后對病毒感染影響的研究
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 細胞和病毒
            1.1.2 引物設(shè)計與合成
            1.1.3 主要試劑和耗材
        1.2 方法
            1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
            1.2.2 pMD-Actin質(zhì)粒構(gòu)建
            1.2.3 檢測CSFV實時熒光定量RT-PCR方法的建立
            1.2.4 實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV蛋白細胞系中病毒滴度
    2 結(jié)果
        2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建和提取
        2.2 檢測CSFV熒光實時定量RT-PCR方法建立
            2.2.1 檢測CSFV基因和β-Actin基因的競爭曲線
            2.2.2 直線回歸方程的建立
        2.3 實時熒光定量RT-PCR檢測CSFV蛋白細胞系中病毒滴度
    3討論分析
    4 小結(jié)
第五章 EO分泌及其在CSFV釋放中的作用研究
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 細胞和病毒
            1.1.2 主要試劑和耗材
        1.2 方法
            1.2.1 轉(zhuǎn)染細胞中熒光蛋白定位分析
            1.2.2 熒光顯微鏡檢測細胞培養(yǎng)基中融合蛋白
            1.2.3 Western blotting檢測細胞培養(yǎng)基中融合蛋白
            1.2.4 CSFV感染蛋白細胞系中病毒滴度的檢測
            1.2.5 CSFV感染細胞培養(yǎng)基中病毒分布情況
    2 結(jié)果
        2.1 轉(zhuǎn)染細胞熒光蛋白定位分析
        2.2 熒光顯微鏡檢測細胞培養(yǎng)基中融合蛋白
        2.3 Western blotting檢測細胞培養(yǎng)基中融合蛋白
        2.4 CSFV感染蛋白細胞系中病毒滴度的檢測
        2.5 CSFV感染細胞培養(yǎng)基中病毒粒子分析
    3 討論分析
    4 小結(jié)
全文總結(jié)及論文創(chuàng)新之處
參考文獻
附錄
縮略詞中英文對照表
致謝
個人簡歷



本文編號：3779704