FHL2(four and a half LIM domains protein 2)屬于 LIM-Only 蛋白家族中的一員,其作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子參與基因表達、細胞增殖分化、細胞遷移和凋亡等諸多生理過程,當(dāng)前研究多集中于人和小鼠。本課題組對連續(xù)產(chǎn)多羔和產(chǎn)單羔的綿羊卵巢組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),FHL2在兩組中的表達差異顯著,推測FHL2對綿羊卵泡發(fā)育具有重要調(diào)控作用。為證實此推測,本文開展了綿羊不同組織中FHL2基因表達、綿羊卵巢中FHL2基因克隆及生物信息學(xué)分析、FHL2基因在綿羊卵巢及顆粒細胞中的表達及定位研究;通過構(gòu)建FHL2過表達和siRNA干擾兩種顆粒細胞模型,研究FHL2對綿羊顆粒細胞生長、類固醇激素分泌及相關(guān)基因表達的影響;通過構(gòu)建綿羊卵巢組織的酵母雙雜交CDNA文庫,篩選與FHL2互作的宿主蛋白,并進行初步驗證。旨在揭示FHL2調(diào)控綿羊卵泡發(fā)育的分子機制。本研究采用Real-time PCR(RT-PCR)方法檢測FHL2基因在綿羊不同組織部位的表達水平;利用分子克隆技術(shù)獲得綿羊FHL2基因的編碼序列,生物信息學(xué)分析比較不同物種間序列同源性和進化關(guān)系;利用免疫組化技術(shù)檢測F...

【文章頁數(shù)】：139 頁

【學(xué)位級別】：博士

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 顆粒細胞在哺乳動物卵泡發(fā)育中的作用
        1.1.1 哺乳動物卵泡發(fā)育的特點
        1.1.2 卵泡發(fā)育的調(diào)控
        1.1.3 顆粒細胞的功能
        1.1.4 顆粒細胞對卵泡發(fā)育的影響
        1.1.5 顆粒細胞對卵泡閉鎖的影響
    1.2 FHL2基因的研究進展
        1.2.1 FHL2基因的結(jié)構(gòu)
        1.2.2 FHL2基因的表達與細胞定位
        1.2.3 FHL2基因的主要生物學(xué)功能
        1.2.4 FHL2影響卵巢顆粒細胞的功能研究
    1.3 蛋白質(zhì)互作研究進展
        1.3.1 酵母雙雜交技術(shù)
        1.3.2 酵母雙雜交技術(shù)的特點
        1.3.3 酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用
    1.4 本研究的目的和意義
2 綿羊FHL2基因的克隆鑒定及表達和定位
    2.1 材料
        2.1.1 樣品來源
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 實驗主要溶液配制
        2.1.5 主要生物信息學(xué)分析軟件
    2.2 方法
        2.2.1 FHL2基因在綿羊不同組織中的表達量分析
        2.2.2 綿羊FHL2基因的克隆鑒定及生物信息學(xué)分析
        2.2.3 免疫組化分析
        2.2.4 綿羊卵巢顆粒細胞的原代培養(yǎng)及鑒定
        2.2.5 FHL2在綿羊卵巢顆粒細胞中的表達分析
        2.2.6 細胞定位
        2.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 FHL2基因在綿羊不同組織中的表達量分析
        2.3.2 綿羊FHL2基因CDS序列克隆及生物信息學(xué)分析
        2.3.3 FHL2在綿羊卵巢組織中的表達定位
        2.3.4 綿羊卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)的形態(tài)與特征
        2.3.5 FHL2在體外培養(yǎng)的綿羊卵巢顆粒細胞中的表達定位
        2.3.6 Western Blot檢測綿羊卵巢顆粒細胞中FHL2的表達
    2.4 討論
        2.4.1 體外分離培養(yǎng)綿羊原代卵巢顆粒細胞
        2.4.2 FHL2的表達及細胞定位研究
    2.5 小結(jié)
3 綿羊FHL2基因過表達及siRNA干擾效果研究
    3.1 材料
        3.1.1 樣品來源
        3.1.2 主要試劑與耗材
        3.1.3 試驗主要儀器設(shè)備
        3.1.4 主要溶液的配置
    3.2 方法
        3.2.1 真核表達載體pcDNA3.1-FHL2載體的構(gòu)建與鑒定
        3.2.2 過表達載體pcDNA3.1-FHL2轉(zhuǎn)染綿羊卵巢顆粒細胞
        3.2.3 siRNA的設(shè)計合成和干擾效果檢測
        3.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 真核表達載體pcDNA3.1-FHL2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        3.3.2 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對FHL2mRNA和蛋白表達水平的影響
        3.3.3 mRNA水平上檢測siFHL2的干擾效果
        3.3.4 蛋白水平上檢測siFHL2的干擾效果
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
4 FHL2基因?qū)d羊卵巢顆粒細胞功能的影響研究
    4.1 材料
        4.1.1 樣品來源
        4.1.2 主要試劑與耗材
        4.1.3 試驗主要儀器設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 FHL2基因過表達對綿羊卵巢顆粒功能的影響
        4.2.2 干擾FHL2基因?qū)d羊卵巢顆粒細胞功能的影響
        4.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 過表達和干擾FHL2表達后對綿羊顆粒細胞形態(tài)變化的影響
        4.3.2 FHL2對綿羊卵巢顆粒細胞增殖的影響
        4.3.3 FHL2對綿羊卵巢顆粒細胞凋亡的影響
        4.3.4 FHL2對綿羊卵巢顆粒細胞周期的影響
        4.3.5 FHL2對綿羊卵巢顆粒細胞激素分泌的影響
    4.4 討論
        4.4.1 FHL2對細胞周期的影響
        4.4.2 FHL2對細胞凋亡的影響
        4.4.3 FHL2對激素分泌水平的影響
    4.5 小結(jié)
5 綿羊卵巢組織細胞酵母雙雜交CDNA文庫的構(gòu)建及FHL2互作蛋白的篩選
    5.1 材料
        5.1.1 試驗材料
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要溶液配制
    5.2 方法
        5.2.1 綿羊卵巢組織細胞酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及鑒定
        5.2.2 綿羊FHL2基因酵母雙雜交誘餌載體的構(gòu)建及鑒定
        5.2.3 利用所構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與FHL2互作的蛋白
        5.2.4 FHL2與篩選宿主蛋白的一對一互作驗證
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 綿羊卵巢酵母雙雜交文庫的構(gòu)建
        5.3.2 pGBKT7-FHL2酵母誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.3.3 酵母雙雜交互作蛋白對照實驗
        5.3.4 篩選與FHL2相互作用的蛋白
        5.3.5 候選克隆質(zhì)粒測序結(jié)果分析
        5.3.6 FHL2與篩選宿主蛋白互作的驗證
    5.4 討論
        5.4.1 酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建
        5.4.2 酵母誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.4.3 利用酵母雙雜交篩選互作蛋白研究
    5.5 小結(jié)
6 FHL2在TGF-β信號通路中對綿羊卵巢顆粒細胞的調(diào)控作用
    6.1 材料
        6.1.1 樣品來源
        6.1.2 試驗主要溶液配制
    6.2 方法
        6.2.1 綿羊TGF-β1蛋白的構(gòu)建和表達
        6.2.2 添加外源蛋白TGF-β1
        6.2.3 FHL2表達對TGF-β1及TGF-βR基因的影響
        6.2.4 TGF-β1抑制劑處理顆粒細胞
        6.2.5 TGF-β1調(diào)控FHL2在不同信號通路中的作用研究
        6.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計
    6.3 結(jié)果
        6.3.1 真核表達載體pFUSERTL1-TGF-β1重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
        6.3.2 Western Blot鑒定TGF-β1蛋白的表達
        6.3.3 TGF-β1促進卵巢顆粒細胞中FHL2的表達
        6.3.4 FHL2對TGF-β1、TGF-βR基因表達的影響
        6.3.5 TGF-β信號通路對FHL2、TGF-β1和TGF-βR表達的影響
        6.3.6 TGF-β1參與調(diào)控FHL2基因表達的信號通路研究
    6.4 討論
        6.4.1 TGF-β1調(diào)控顆粒細胞中FHL2的表達
        6.4.2 TGF-β1調(diào)控FHL2基因的信號通路研究
    6.5 小結(jié)
7 結(jié)論
8 本研究創(chuàng)新點
參考文獻
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
作者簡介
致謝
附件



本文編號：3776973