發(fā)布時間：2023-03-31 22:16

　　雞白痢沙門菌是嚴重危害我國家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的常見病原菌之一,雛雞被感染后發(fā)病率和死亡率極高。該菌既可以水平傳播,也可以垂直傳播,難以在種禽養(yǎng)殖場被清除凈化。簡單高效低成本地防控雞群中雞白痢沙門菌成為當前亟待解決的難題。疫苗接種被認為是降低雞群感染和防控雞白痢沙門菌的有效措施之一。沙門菌spiC基因是重要的毒力基因,該基因缺失可顯著致弱沙門菌的毒力,并恰當?shù)仄胶庖呙绾蜻x株的毒力和免疫原性。脂多糖不僅是細菌外膜的組成部分,也是沙門菌毒力的重要因素之一,常被選為DIVA疫苗的靶標分子。沙門菌減毒疫苗候選株主要運用現(xiàn)代基因工程的同源重組方法敲除一個或多個基因所得,具有遺傳背景清晰,操作容易,制備快捷等優(yōu)點;但常用的同源重組方法,由于篩選的需要,基因缺失株往往殘留抗生素基因或部分外源片段,給缺失基因的恢復(fù)或其它外源基因的插入提供可能性,遺傳穩(wěn)定性存在安全隱患。因此,為了滿足轉(zhuǎn)基因微生物安全評估的要求,通過無痕基因敲除技術(shù)構(gòu)建基因缺失疫苗候選株,不殘留有任何外源基因或堿基,就顯得十分必要。本研究利用無痕敲除的同源重組方法,同時缺失spiC和rfaL或rfaH基因,構(gòu)建雞白痢沙門菌S06004△s...

【文章頁數(shù)】：64 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
符號說明
綜述 禽沙門菌病的危害與防控研究進展
    1 禽沙門菌病的流行與危害
    2 致病機制
    3 禽沙門菌病防控措施
        3.1 噬菌體
        3.2 益生菌
        3.3 抗生素
        3.4 疫苗
            3.4.1 滅活疫苗
            3.4.2 亞單位疫苗
            3.4.3 減毒活疫苗
            3.4.4 基因工程構(gòu)建新型疫苗
                3.4.4.1 構(gòu)建有痕的基因工程疫苗
                3.4.4.2 減毒活疫苗的無痕構(gòu)建
            3.4.5 動物用轉(zhuǎn)基因微生物安全評估要求
    4 結(jié)語
第一章 雞白痢沙門菌疫苗候選株的無痕構(gòu)建與生物學(xué)特性研究
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 菌株與質(zhì)粒
            1.1.2 實驗動物
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 主要儀器設(shè)備
        1.2 方法
            1.2.1 引物設(shè)計與合成
            1.2.2 靶片段的擴增
            1.2.3 線性自殺載體的制備
            1.2.4 感受態(tài)細菌的制備
            1.2.5 電擊轉(zhuǎn)化
            1.2.6 供體菌E.coli.χ7213與受體菌S06004△spiC接合轉(zhuǎn)移及篩選陽性菌
            1.2.7 雙基因缺失株S06004△spiC△rfaH、S06004△spiC△rfaL的生化特性鑒定
            1.2.8 雙基因缺失株S06004△spiC△rfaH、S06004△spiC△rfaL的生長特性鑒定
            1.2.9 雙基因缺失株S06004△spiC△rfaH、S06004△spiC△rfaL的LD₅₀毒力測定
            1.2.10 雙基因缺失株S06004△spiC△rfaH、S06004△spiC△rfaL對HD-11細胞的黏附、侵襲以及增殖實驗
            1.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    2 結(jié)果
        2.1 S06004△spiC△rfaH和S06004△spiC△rfaL的構(gòu)建與鑒定
        2.2 雙基因缺失株S06004△spiC△rfaH和S06004△spiC△rfaL的生化特性鑒定
        2.3 雙基因缺失株S06004△spiC△rfaH和S06004△spiC△rfaL的生長特性鑒定
        2.4 雙基因缺失株S06004△piC△rfaH和S06004△spiC△rfaL的LD₅₀毒力測定
        2.5 雙基因缺失株S06004△spiC△rfaH和S06004△spiC△rfaL對HD-11細胞的黏附與侵襲
        2.6 雙基因缺失株S06004△spiC△rfaH和S06004△spiC△rfaL在HD-11細胞內(nèi)增殖
    3 討論
第二章 雞白痢沙門菌疫苗候選株安全性與免疫保護效力評價
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 菌株
            1.1.2 實驗動物
            1.1.3 主要試劑
            1.1.4 主要儀器設(shè)備
        1.2 方法
            1.2.1 引物設(shè)計與合成
            1.2.2 疫苗候選株的制備與免疫
            1.2.3 雛雞接種后體重變化
            1.2.4 疫苗候選株在雛雞體內(nèi)動態(tài)消減情況
            1.2.5 疫苗候選株免疫雛雞后組織病理學(xué)觀察
            1.2.6 間接ELISA測定血清IgG抗體效價
            1.2.7 細胞因子檢測
            1.2.8 疫苗候選株肌注途徑對雛雞的免疫保護效力
            1.2.9 疫苗候選株口服途徑的免疫保護效力
            1.2.10 疫苗候選株的DIVA功能
            1.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    2 結(jié)果
        2.1 雛雞接種后體重變化
        2.2 疫苗候選株在雛雞體內(nèi)定殖情況
        2.3 疫苗候選株免疫雛雞后組織病理學(xué)觀察
        2.4 間接ELISA測定血清IgG抗體效價
        2.5 細胞因子檢測
        2.6 疫苗候選株肌注途徑對雛雞的免疫保護效力
        2.7 疫苗候選株口服途徑的免疫保護效力
        2.8 疫苗候選株的DIVA功能
    3 討論
參考文獻
致謝



本文編號：3775889