發(fā)布時(shí)間：2023-03-25 02:03

　　輪狀病毒(Rotavirus,RV)是嬰幼兒和幼齡動(dòng)物腹瀉的主要病因,其所編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NSP4,功能之一是作為腸毒素引發(fā)腹瀉,嚴(yán)重威脅著嬰幼兒健康和養(yǎng)殖業(yè)。據(jù)報(bào)道,在RV感染過(guò)程中,整聯(lián)蛋白α2β1作為RV的主要受體之一,涉及NSP4的表達(dá)及NSP4與細(xì)胞內(nèi)鈣離子、整聯(lián)蛋白受體和相關(guān)酶的相互作用;已知益生菌及其培養(yǎng)上清能抑制RV感染,但是是否和如何通過(guò)NSP4發(fā)揮作用,有待近一步研究。據(jù)此,本研究運(yùn)用食淀粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus,L.A)及其培養(yǎng)上清,先后完成了食淀粉乳桿菌及其培養(yǎng)上清體內(nèi)外抗RV能力分析;重組豬輪狀病毒NSP4蛋白的表達(dá)、鑒定以及NSP4重組蛋白的免疫原性測(cè)定;體內(nèi)外抗RV對(duì)細(xì)胞和空腸組織內(nèi)NSP4、鈣離子、磷脂酶C、Dicer和整聯(lián)蛋白α2β1的檢測(cè),探討其對(duì)NSP4表達(dá)的部分調(diào)節(jié)機(jī)制,闡釋其在抗豬輪狀病毒(Procine Rotavirus,PoRV)中的效應(yīng)。為闡明益生菌與培養(yǎng)上清在抗RV作用的異同,該研究分為兩部分,體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。體外實(shí)驗(yàn)中使用IPEC-J2細(xì)胞為平臺(tái),以A組豬輪狀病毒OSU株為作用因子,...

【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
1 引言
    1.1 輪狀病毒概況
        1.1.1 輪狀病毒病原學(xué)特征
        1.1.2 NSP4在RV發(fā)病機(jī)制中的作用
        1.1.3 RV整聯(lián)蛋白受體的研究
    1.2 益生菌概況
        1.2.1 益生菌的定義
        1.2.2 益生菌的功能效應(yīng)和特性
        1.2.3 益生菌的安全性
        1.2.4 益生菌對(duì)腸道微生態(tài)系統(tǒng)的影響
    1.3 益生菌抗病毒概況
        1.3.1 益生菌抗病毒作用的研究現(xiàn)狀
        1.3.2 益生菌抗病毒機(jī)制研究進(jìn)展
        1.3.3 食淀粉乳桿菌及其抗病毒作用
        1.3.4 腸上皮細(xì)胞的應(yīng)用
    1.4 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌毒株、質(zhì)粒、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要溶劑配制
        2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    2.2 方法
        2.2.1 食淀粉乳桿菌培養(yǎng)上清抗RV能力的檢測(cè)技術(shù)
        2.2.2 重組豬輪狀病毒NSP4 蛋白的表達(dá)
        2.2.3 重組蛋白的純化
        2.2.4 重組蛋白的Western-blot鑒定
        2.2.5 重組蛋白免疫原性測(cè)定
        2.2.6 食淀粉乳桿菌培養(yǎng)上清對(duì)IPEC-J2 細(xì)胞內(nèi)NSP4 mRNA及相關(guān)因子的作用
        2.2.7 食淀粉乳桿菌對(duì)乳鼠空腸組織內(nèi)NSP4 mRNA及相關(guān)因子的作用
        2.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
3 結(jié)果
    3.1 益生菌抗病毒功能測(cè)定
        3.1.1 IPEC-J2 細(xì)胞活力
        3.1.2 RV毒力測(cè)定
        3.1.3食淀粉乳桿菌培養(yǎng)上清的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)
        3.1.4 食淀粉乳桿菌培養(yǎng)上清對(duì)RV病毒的抑制率
    3.2 重組RV NSP4 蛋白的表達(dá)
        3.2.1 RV NSP4 基因的克隆
        3.2.2 重組菌的構(gòu)建
        3.2.3 重組蛋白的表達(dá)
    3.3 重組蛋白的純化和免疫原性鑒定
        3.3.1 重組蛋白的純化
        3.3.2 Western-blot免疫原性鑒定
    3.4 免疫抗體檢測(cè)
    3.5 食淀粉乳桿菌培養(yǎng)上清短長(zhǎng)期預(yù)處理IPEC-J2 細(xì)胞抗RV中 NSP4 相關(guān)因素分析
        3.5.1 食淀粉乳桿菌培養(yǎng)上清短長(zhǎng)期預(yù)處理IPEC-J2 細(xì)胞抗RV最強(qiáng)組
        3.5.2 間接免疫熒光鑒定
        3.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)食淀粉乳桿菌培養(yǎng)上清對(duì)NSP4 mRNA的影響
        3.5.4 IPEC-J2 細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定
        3.5.5 IPEC-J2 細(xì)胞內(nèi)磷脂酶C測(cè)定
        3.5.6 IPEC-J2 細(xì)胞整聯(lián)蛋白α2β1 測(cè)定
        3.5.7 IPEC-J2 細(xì)胞內(nèi)Dicer測(cè)定
    3.6 食淀粉乳桿菌抗RV中 NSP4 相關(guān)因素分析
        3.6.1 乳鼠體重變化及體重增長(zhǎng)率
        3.6.2 輪狀病毒ELISA檢測(cè)
        3.6.3 食淀粉乳桿菌對(duì)乳鼠空腸組織NSP4 MRNA水平的影響
        3.6.4 食淀粉乳桿菌對(duì)乳鼠空腸組織中鈣含量的影響
        3.6.5 乳鼠空腸組織中磷脂酶C的測(cè)定
        3.6.6 乳鼠空腸組織整聯(lián)蛋白α2β1 的測(cè)定
        3.6.7 乳鼠空腸組織中Dicer的測(cè)定
4 討論
    4.1 食淀粉乳桿菌培養(yǎng)上清體外抗RV作用
    4.2 食淀粉乳桿菌對(duì)RV感染乳鼠后的相關(guān)效應(yīng)
    4.3 食淀粉乳桿菌及其培養(yǎng)上清在體內(nèi)外對(duì)NSP4 功效的影響
    4.4 食淀粉乳桿菌及其培養(yǎng)上清在體內(nèi)外對(duì)NSP4 表達(dá)及其相關(guān)因素的相互作用
5 結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3770307