Myostatin,肌肉生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子,是一種分泌型糖蛋白,主要在動(dòng)物的骨骼肌中特異性表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),Myostatin基因超量表達(dá)可以導(dǎo)致動(dòng)物的肌肉萎縮；而Myostatin基因的突變可以使動(dòng)物產(chǎn)生雙肌現(xiàn)象。因此,利用Myostatin基因突變體構(gòu)建基因疫苗并研究其對畜禽肌肉生長發(fā)育的影響,不僅可以從理論上發(fā)現(xiàn)Myostatin發(fā)揮作用的重要位點(diǎn),而且可以從實(shí)踐上探討提高肉產(chǎn)量和肉品質(zhì)的新途徑。 本試驗(yàn)根據(jù)NCBI上已有的豬、綿羊Myostatin序列(登錄號分別為NM₂14435, NM₀01009428.1)設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR從豬、綿羊骨骼肌RNA中擴(kuò)增豬、綿羊Myostatin1128bp的CDS區(qū)序列,并連接至pEASY-T3載體,命名為pEASY-T3-MSTN,進(jìn)一步在起始密碼子ATG前添加Kozak序列(GCC ACC),再次克隆至pEASY-T3載體。然后亞克隆至pVAX真核表達(dá)載體,命名為豬或綿羊pVAX-MSTN.將豬Myostatin基因兩位點(diǎn)突變同上方法連接至pVAX真核表達(dá)載體,命名為pVAX-MST...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
前言
文獻(xiàn)綜述
    1 Myostatin基因的研究進(jìn)展
        1.1 Myostatin基因的發(fā)現(xiàn)
        1.2 Myostatin基因的分子結(jié)構(gòu)、組織特異性及同源性
        1.3 Myostatin蛋白的合成及生物學(xué)特性
        1.4 Myostatin的作用
        1.5 綿羊、豬Myostatin基因的研究進(jìn)展
    2 基因疫苗的研究進(jìn)展
        2.1 DNA疫苗的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷史
        2.2 基因免疫目的基因的來源
        2.3 基因疫苗表達(dá)載體的選擇
        2.4 基因免疫中免疫佐劑的選擇
        2.5 基因疫苗的接種途徑
        2.6 基因免疫的優(yōu)點(diǎn)
    3 Myostatin基因疫苗的研究進(jìn)展
本試驗(yàn)的研究目的和意義
    一、Myostatin基因突變表達(dá)載體的構(gòu)建
        1 材料和方法
            1.1 動(dòng)物材料、菌株和質(zhì)粒載體
                1.2 分子試驗(yàn)生化試劑
                1.3 主要儀器
                1.4 緩沖液與常用試劑的配制
                1.5 引物設(shè)計(jì)和序列分析軟件
            2 基本試驗(yàn)方法
                2.1 豬、綿羊骨骼肌RNA提取、反轉(zhuǎn)錄
                    2.1.1 骨骼肌RNA的提取
                    2.1.2 RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA
                2.2 PCR擴(kuò)增豬、綿羊Myostatin基因序列
                    2.2.1 PCR擴(kuò)增目的片段引物設(shè)計(jì)
                    2.2.2 Myostatin目的基因的擴(kuò)增
                    2.2.3 PCR的反應(yīng)過程
                2.3 瓊脂糖凝膠電泳
                2.4 目的片段的瓊脂糖凝膠回收
                2.5 目的片段連接至pEASY-T3載體、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
                    2.5.1 豬、綿羊Myostatin基因連接至pEASY-T3載體
                    2.5.2 豬Myostatin基因連接至pEASY-T3載體的過程
                    2.5.3 綿羊Myostatin基因連接至pEASY-T3載體
                    2.5.4 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
                2.6 質(zhì)粒小量提取
                2.7 質(zhì)粒進(jìn)行單酶切鑒定
                2.8 Myostatin基因ATG前添加kozak序列
                2.9 豬、綿羊Myostatin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
                    2.9.1 目的片段前添加kozak序列
                    2.9.2 目的片段與載體的雙酶切
                    2.9.3 將加有kozak序列的Myostatin亞克隆至pVAX載體
                    2.9.4 豬Myostatin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建過程
                    2.9.5 綿羊Myostatin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建過程
                2.10 豬Myostatin基因突變表達(dá)載體的構(gòu)建
                    2.10.1 Myostatin基因突變表達(dá)載體構(gòu)建
                    2.10.2 豬Myostatin基因突變第一個(gè)表達(dá)載體的構(gòu)建
                    2.10.3 豬Myostatin基因第二個(gè)突變表達(dá)載體的構(gòu)建
        結(jié)果與分析
            1、豬、綿羊骨骼肌RNA提取
            2、豬、綿羊Myostatin基因cds區(qū)的PCR擴(kuò)增
                2.1 豬、綿羊Myostatin基因cds區(qū)的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果
                2.2 豬Myostatin基因PCR擴(kuò)增測序結(jié)果
                2.3 綿羊Myostatin基因PCR擴(kuò)增測序結(jié)果
            3、目的片段與pEASY-T3載體的連接及目的片段的亞克隆
            4、豬Myostatin基因突變表達(dá)載體構(gòu)建
                4.1 pVAX-MSTN(T1)載體的構(gòu)建
                    4.1.1 pVAX-MSTN(T1)載體的雙酶切電泳結(jié)果
                    4.1.2 pVAX-MSTN (T1 )突變載體的部分測序結(jié)果
                4.2 pVAX-MSTN(T2)的構(gòu)建
                    4.2.1 pVAX-MSTN(T2)載體的雙酶切電泳結(jié)果
                    4.2.2 pVAX-MSTN (T2)突變載體的部分測序結(jié)果
        討論
        小結(jié)
    二、豬Myostatin表達(dá)載體免疫小鼠
        材料與方法
            1 試驗(yàn)材料
                1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試劑
                1.2 主要儀器
                1.3 主要試劑
            2 基本實(shí)驗(yàn)方法
                2.1 質(zhì)粒大量提取
                2.2 小鼠免疫實(shí)驗(yàn)
                2.3 樣品的采集與制備
                2.3.1 血清的收集
                2.3.2 肌肉的采集與固定
                2.4 ELISA檢測抗體
                2.5 石蠟切片的制備
                2.6 肌肉組織顯微結(jié)構(gòu)觀察
                2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和處理
        結(jié)果與分析
            1、小鼠體重變化
            2、小鼠骨骼肌顯微結(jié)構(gòu)的觀察
            3、ELISA檢測小鼠血清Myostatin特異性抗體
                3.1 試驗(yàn)測得標(biāo)準(zhǔn)品和各個(gè)試驗(yàn)組OD值結(jié)果
                3.2 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值和濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
                3.3 ELISA檢測小鼠血清Myostatin特異性抗體濃度
        討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
Abstract
致謝



本文編號：3767266