本文關(guān)鍵詞：TUDCA處理供體細胞對牛核移植胚胎早期發(fā)育的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：供體細胞血清饑餓處理被認為是體細胞核移植技術(shù)成功的一個重要步驟,通過血清饑餓可以使大部分供體細胞停滯在G0/G1期,提高了其在核移植后卵胞質(zhì)中重編程和發(fā)育能力。但突然除去培養(yǎng)液中的血清,培養(yǎng)的細胞處于逆境,容易使其產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng),從而增加了細胞損傷的幾率。�；切苊撗跄懰�(TUDCA)是一種抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的小分子物質(zhì)。本研究在血清饑餓的牛胎兒成纖維細胞中添加TUDCA,減少因血清饑餓而引起的應(yīng)激反應(yīng),研究其對克隆胚發(fā)育的影響,主要研究結(jié)果如下:1、用0、50、100、150、200μM TUDC A處理牛胎兒成纖維細胞后,通過對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)表達基因GRP78和CHOP的檢測,篩選合適的處理濃度。研究顯示100μM TUDCA處理GRP78和C HOP表達量顯著低于其他各組(P0.05),表明100μM TUDCA是處理最適濃度。2、采用100μM TUDCA處理血清饑餓的牛胎兒成纖維細胞,檢測其對細胞生長狀態(tài)、凋亡基因表達和重編程相關(guān)基因的影響。結(jié)果說明,TUDCA處理組可以降低細胞凋亡率(1.1±0.2%vs 6.4±0.4%,P0.05),對細胞周期影響無差異;同時凋亡相關(guān)基因P53和BAX的表達顯著下降(P0.05);表觀修飾基因HDAC1和DNMT1的表達也顯著下降(P0.05),TUDCA處理的牛胎兒成纖維細胞中H3K9Ac水平是對照組的2.3倍(P0.05)。3、TUDCA處理的牛胎兒成纖維細胞用作體細胞核移植的供體細胞。結(jié)果顯示,核移植后,TUDCA處理與對照組相比,胚胎融合率(78.46%vs 68.89%,P0.05);卵裂率(92.09%vs 86.56%,P0.05);和囊胚率(37.87%vs 30.43%,P0.05)都顯著提高;同時囊胚中P53、HDAC1、DNMT1的表達水平也顯著低于對照組(P0.05)。囊胚細胞凋亡率也顯著降低(P0.05)。綜上所述,100μM TUDCA處理成纖維細胞,可以減少血清饑餓供體細胞的應(yīng)激反應(yīng),作為供體細胞有利于克隆胚的發(fā)育。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 胎兒成纖維細胞 �；切苊撗跄懰� 體細胞核移植 牛
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S814
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-11
• 文獻綜述11-23
• 第一章 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與TUDCA的研究概況11-15
• 1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機制11-13
• 1.1.1 PERK途徑11-12
• 1.1.2 IRE1途徑12
• 1.1.3 ATF6途徑12-13
• 1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在卵母細胞及早期胚胎中的研究13-14
• 1.3 牛磺熊脫氧膽酸14-15
• 第二章 體細胞核移植15-23
• 2.1 克隆胚核重構(gòu)15-16
• 2.2 DNA甲基化與重編程16-18
• 2.3 組蛋白與重編程18
• 2.4 X染色體失活與重編程18-19
• 2.5 提高體細胞核移植效率的方法19-23
• 2.5.1 供體細胞選擇19-20
• 2.5.2 受體卵母細胞處理20
• 2.5.3 卵母細胞激活20-21
• 2.5.4 供體細胞和克隆胚胎的藥物處理21-23
• 實驗部分23-43
• 第三章 TUDCA對血清饑餓處理牛胎兒成纖維細胞的影響23-34
• 3.1 材料和設(shè)備23-24
• 3.1.1 儀器設(shè)備和耗材23-24
• 3.1.2 試劑和配制方法24
• 3.2 實驗方法24-28
• 3.2.1 原代牛皮膚成纖維細胞的培養(yǎng)24
• 3.2.2 細胞的傳代培養(yǎng)24-25
• 3.2.3 細胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄25
• 3.2.4 實時熒光定量PCR檢測25-27
• 3.2.5 細胞周期和凋亡檢測27
• 3.2.6 成纖維細胞的H3K9ac染色27
• 3.2.7 定量熒光強度27-28
• 3.2.8 實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析28
• 3.3 實驗結(jié)果28-31
• 3.3.1 不同濃度TUDCA對細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達的影響28
• 3.3.2 TUDCA對牛成纖維細胞周期和凋亡的影響28-29
• 3.3.4 凋亡相關(guān)基因在成纖維細胞中表達29-30
• 3.3.5 100μM TUDCA處理對DNMT1和HDAC1表達的影響30
• 3.3.6 100μM TUDCA對成纖維細胞H3K9ac水平的影響30-31
• 3.4 討論31-33
• 3.5 小結(jié)33-34
• 第四章 TUDCA處理供體細胞對牛體細胞核移植 早期胚胎發(fā)育的影響34-43
• 4.1 實驗材料34-35
• 4.1.1 儀器設(shè)備34-35
• 4.1.2 耗材、試劑和配方35
• 4.2 實驗方法35-37
• 4.2.1 供體細胞的準備35
• 4.2.2 卵母細胞的收集和體外成熟(IVM)培養(yǎng)35-36
• 4.2.3 體細胞核移植、融合、激活和胚胎培養(yǎng)36
• 4.2.4 實時熒光定量PCR檢測36-37
• 4.2.5 囊胚的凋亡染色37
• 4.2.6 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析37
• 4.3 實驗結(jié)果37-41
• 4.3.1 TUDCA對克隆胚體外發(fā)育的影響37-39
• 4.3.2 TUDCA對體細胞核移植胚胎重編程的影響39
• 4.3.3 TUDCA對克隆胚凋亡率的影響39-41
• 4.4 討論41-42
• 4.5 小結(jié)42-43
• 全文結(jié)論43-44
• 參考文獻44-52
• 致謝52-53
• 作者簡介53

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  本文關(guān)鍵詞：TUDCA處理供體細胞對牛核移植胚胎早期發(fā)育的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：375470