單核細(xì)胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）是革蘭氏陽性菌無芽胞桿菌，同時(shí)也是重要的人獸共患食源性病原菌，可引發(fā)胃腸炎、敗血癥、腦膜炎和流產(chǎn)等臨床癥狀。在革蘭氏陽性菌中，LPXTG錨定蛋白、毒素蛋白、菌毛和鞭毛形成相關(guān)蛋白都是通過二硫鍵形成蛋白系統(tǒng)（Dsb）中的DsbA修飾后才能通過Sec分泌系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。但是單增李斯特菌沒有DsbA，只有Lmo0964和Lmo1059在基因組中被注釋為DsbA-like蛋白。那么，單增李斯特菌是如何通過Lmo0964和SecY實(shí)現(xiàn)蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的呢？首先，我們通過原核表達(dá)系統(tǒng)，成功的在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)了單增李斯特菌的SecY（Lmo2612）和Lmo0964蛋白，表達(dá)量分別為0.2mg/ml、10mg/ml。我們利用新西蘭白兔成功的制備了SecY和Lmo0964的抗體，經(jīng)Western blot檢測，抗體效價(jià)均為1：1000以上，其中SecY在PVDF膜上呈現(xiàn)單一的條帶，這說明制備的抗體具有較高的特異性。利用蛋白酶K進(jìn)行的蛋白定位實(shí)驗(yàn)表明：與革蘭氏陰性菌的DsbA不同，單增李斯特菌的Lmo0964為胞內(nèi)蛋白。為了進(jìn)一步...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 李斯特菌介紹
        1.1.1 李斯特菌簡介
        1.1.2 單核細(xì)胞增多性李斯特菌的致病力
        1.1.3 單增李斯特菌的致病機(jī)制及主要毒力因子
    1.2 李斯特菌的 SecY 系統(tǒng)研究進(jìn)展
    1.3 李斯特菌的 DsbA 蛋白研究進(jìn)展
        1.3.1 二硫鍵的形成
        1.3.2 Dsb 家族蛋白
        1.3.3 DsbA 蛋白
        1.3.4 Lmo0964 蛋白
第二章 單增李斯特菌 SecY 蛋白的原核表達(dá)、純化和抗體制備
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 Lm EGDe 細(xì)菌的培養(yǎng)
        2.2.2 Lm EGDe 基因組 DNA 的提取
        2.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.2.4 PCR 擴(kuò)增 secY 基因
        2.2.5 PCR 產(chǎn)物的回收
        2.2.6 SecY 蛋白的原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
        2.2.7 SecY 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化
        2.2.8 將制備好的抗體進(jìn)行 Western blot 分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 EGDe secY 基因片段的 PCR 擴(kuò)增
        2.3.2 重組質(zhì)粒 pSL032 的鑒定
        2.3.3 SecY 蛋白的表達(dá)純化，抗體制備，及 Western blot 分析
    2.4 討論
第三章 單增李斯特菌 Lmo0964 蛋白的原核表達(dá)、純化和抗體制備
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌種及質(zhì)粒
        3.1.2 主要工具酶及試劑
        3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器詳見 2.1.3
        3.1.4 主要試劑及配制詳見 2.1.4
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 Lm EGDe 細(xì)菌的培養(yǎng)
        3.2.2 Lm EGDe 基因組 DNA 的提取詳見 2.2.2.1
        3.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成
        3.2.4 PCR 擴(kuò)增 Lm EGDe lmo0964 基因
        3.2.5 PCR 產(chǎn)物的回收
        3.2.6 lmo0964 基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
        3.2.7 Lmo0964 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化
        3.2.8 蛋白復(fù)性(透析法)
        3.2.9 送上海生工制備Lmo0964蛋白抗體進(jìn)行Western blot 分析
    3.3 結(jié)果分析
        3.3.1 EGDe lmo0964 基因片段的 PCR 擴(kuò)增
        3.3.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
        3.3.3 Lmo0964 蛋白的表達(dá)純化，抗體制備
    3.4 討論
第四章 單核細(xì)胞增多性李斯特菌 lmo0964 基因的敲除
    4.1 單核細(xì)胞增多性李斯特菌基因敲除的原理
    4.2 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.1 菌種及質(zhì)粒
        4.2.2 試劑
        4.2.3 試劑配制
        4.2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 缺失質(zhì)粒的構(gòu)建過程
        4.3.2 回復(fù)突變株的構(gòu)建
        4.3.3 用 Lmo0964 蛋白抗體對單增李斯特菌 EGDe 突變株的 Western blot 分析
    4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.4.1 上游同源臂和下游同源臂的擴(kuò)增及拼接
        4.4.2 目的片段與 pKSV7 載體的連接
        4.4.3 同源重組菌的篩選與鑒定
        4.4.4 回補(bǔ)株的構(gòu)建
        4.4.5 用 Lmo0964 蛋白抗體對單增李斯特菌 EGDe wt，突變株，回復(fù)突
    4.5 討論
第五章 lmo0964 基因缺失株的表型分析及蛋白定位
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            5.1.1.1 試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)
        5.2.2 生長曲線測定
        5.2.3 H₂O₂應(yīng)激實(shí)驗(yàn)
        5.2.4 蛋白酶 K 的方法分離膜蛋白與胞漿蛋白
        5.2.5 細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 單核細(xì)胞增多性李斯特菌運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)
        5.3.2 生長曲線表型
        5.3.3 抗過氧化氫應(yīng)激實(shí)驗(yàn)
        5.3.4 蛋白酶 K 法分離膜蛋白與胞漿蛋白
        5.3.5 細(xì)胞的侵襲及胞內(nèi)感染實(shí)驗(yàn)
    5.4 討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
個(gè)人簡介
致謝



本文編號：3749937