發(fā)布時(shí)間：2023-02-26 02:54

　　肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat,IMF)含量是影響肉品質(zhì)性狀的重要因素,與肉品質(zhì)的嫩度、多汁和風(fēng)味呈正相關(guān)。近三十年以來,品種改良和促生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)措施在獲得高瘦肉率和低背膘厚的同時(shí),導(dǎo)致IMF含量大量減少,極大地降低了豬肉品質(zhì)。如何在不降低豬生長(zhǎng)性能和產(chǎn)肉量的前提下提高IMF含量,已成為動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域研究者亟待研究和解決的重大科學(xué)問題。 本課題對(duì)版納微型豬近交系心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(heart fatty acid binding protein, H-FABP or FABP3)基因進(jìn)行研究,分別從細(xì)胞和組織水平驗(yàn)證過表達(dá)FABP3與IMF含量及其他指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性,并探索其可能的分子機(jī)制。為制備IMF含量豐富和肉品質(zhì)性狀優(yōu)良的豬新品種提供科學(xué)依據(jù)。獲得的主要研究成果有： 1.將FABP3分別插入pcDNA3、pIRES2-EGFP和piggyBac質(zhì)粒,成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3-FABP3、pIRES2-EGFP-FABP3和PB[EGFP,FABP3]。將上述真核表達(dá)載體分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MDCK, BHK-21、HepG2、3T3-L1細(xì)胞,經(jīng)western blot檢測(cè)...

【文章頁數(shù)】：143 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 脂類代謝及其調(diào)控
        1.1.1 脂肪組織概述
        1.1.2 脂肪細(xì)胞分化及調(diào)控
        1.1.3 脂肪沉積及調(diào)控
    1.2 肌內(nèi)脂肪研究進(jìn)展
        1.2.1 肌內(nèi)脂肪的生成
        1.2.2 肌內(nèi)脂肪與肉品質(zhì)的關(guān)系
        1.2.3 營(yíng)養(yǎng)因素對(duì)肌內(nèi)脂肪含量的影響
    1.3 肌內(nèi)脂肪含量的遺傳控制
        1.3.1 脂肪酸結(jié)合蛋白概述
        1.3.2 心臟脂肪酸結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)
        1.3.3 心臟脂肪酸結(jié)合蛋白功能
    1.4 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備方法
        1.4.1 原核顯微注射法
        1.4.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法
        1.4.3 精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移
        1.4.4 胚胎干細(xì)胞法
        1.4.5 體細(xì)胞核移植法
        1.4.6 PiggyBac轉(zhuǎn)座子
    1.5 本研究的意義
第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞
        2.1.3 試劑盒
        2.1.4 酶和Marker
        2.1.5 抗體和引物
        2.1.6 主要試劑和耗材
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
    2.3 主要試劑的配制
        2.3.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備所需試劑的配制
        2.3.2 質(zhì)粒DNA提取所需試劑的配制
        2.3.3 基因組DNA提取所需試劑的配制
        2.3.4 總RNA提取所需試劑的配制
        2.3.5 瓊脂糖凝膠電泳所需試劑的配制
        2.3.6 總蛋白質(zhì)提取所需試劑的配制
        2.3.7 SDS-PAGE所需試劑的配制
        2.3.8 Western blot所需試劑的配制
        2.3.9 細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑的配制
        2.3.10 3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化所需試劑的配制
        2.3.11 油紅O染色實(shí)驗(yàn)所需試劑的配制
        2.3.12 組織切片所需試劑的配制
    2.4 實(shí)驗(yàn)方法
        2.4.1 大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.4.2 質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化
        2.4.3 質(zhì)粒DNA的小量提取
        2.4.4 質(zhì)粒DNA的大量提取
        2.4.5 普通PCR
        2.4.6 高保真PCR
        2.4.7 DNA的酶切
        2.4.8 PCR和酶切產(chǎn)物的切膠回收
        2.4.9 PCR和酶切產(chǎn)物的回收
        2.4.10 DNA的連接及轉(zhuǎn)化
        2.4.11 In-Fusion實(shí)驗(yàn)
        2.4.12 熒光定量PCR
        2.4.13 3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化
        2.4.14 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
        2.4.15 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
        2.4.16 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
        2.4.17 細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
        2.4.18 總RNA的提取
        2.4.19 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
        2.4.20 總蛋白的提取
        2.4.21 Western blot實(shí)驗(yàn)
        2.4.22 油紅O染色
        2.4.23 3T3-L1細(xì)胞甘油三酯含量的測(cè)定
        2.4.24 顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠
        2.4.25 小鼠基因組DNA的提取
        2.4.26 小鼠骨骼肌甘油三酯含量的測(cè)定
        2.4.27 小鼠骨骼肌游離脂肪酸含量的測(cè)定
        2.4.28 小鼠組織石蠟切片
        2.4.29 小鼠骨骼肌冰凍切片
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.1 重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-FABP3和pcDNA3-FABP3的菌液PCR鑒定結(jié)果
        3.1.2 重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-FABP3和pcDNA3-FABP3的酶切鑒定結(jié)果
        3.1.3 重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-FABP3和pcDNA3-FABP3的測(cè)序鑒定結(jié)果
        3.1.4 PiggyBac轉(zhuǎn)座子重組質(zhì)粒PB[FABP3,EGFP]和PB[EGFP]的菌液PCR結(jié)果
        3.1.5 PiggyBac轉(zhuǎn)座子重組質(zhì)粒PB[FABP3,EGFP]和PB[EGFP]的酶切鑒定結(jié)果
        3.1.6 PiggyBac轉(zhuǎn)座子重組質(zhì)粒PB[FABP3,EGFP]和PB[EGFP]的測(cè)序鑒定結(jié)果
        3.1.7 其它真核表達(dá)載體的構(gòu)建結(jié)果
    3.2 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的建立及檢測(cè)
        3.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)
        3.2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果
        3.2.3 小鼠前脂肪細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選
        3.2.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的RT-PCR檢測(cè)
        3.2.5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的western blot檢測(cè)
        3.2.6 細(xì)胞誘導(dǎo)分化及油紅O染色結(jié)果
        3.2.7 細(xì)胞甘油三酯含量測(cè)定結(jié)果
        3.2.8 FABP3上調(diào)對(duì)脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響
    3.3 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備
        3.3.1 轉(zhuǎn)座子表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞結(jié)果
        3.3.2 顯微注射方法制備轉(zhuǎn)基因小鼠
        3.3.3 轉(zhuǎn)基因小鼠基因組水平檢測(cè)結(jié)果
        3.3.4 轉(zhuǎn)基因小鼠RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
        3.3.5 轉(zhuǎn)基因小鼠western blot檢測(cè)結(jié)果
        3.3.6 轉(zhuǎn)基因小鼠活體成像結(jié)果
    3.4 轉(zhuǎn)基因小鼠相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定
        3.4.1 轉(zhuǎn)基因小鼠體重測(cè)量結(jié)果
        3.4.2 轉(zhuǎn)基因小鼠甘油三酯和游離脂肪酸測(cè)定結(jié)果
        3.4.3 轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌冰凍切片結(jié)果
        3.4.4 FABP3過表達(dá)對(duì)小鼠骨骼肌脂代謝的影響
        3.4.5 FABP3過表達(dá)對(duì)肝臟脂代謝的影響
    3.5 討論與展望
第四章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3749668