n-3多不飽和脂肪酸為人體必需脂肪酸,可降低多種疾病發(fā)生的鳳險(xiǎn),n-3的不足及n-6/n-3比例失衡,不僅在發(fā)育階段還在整個(gè)生命過程中對人體各代謝活動(dòng)產(chǎn)生不良影響,但是由于人體內(nèi)缺乏相應(yīng)的酶類導(dǎo)致其合成量較少,必須依賴于食物攝入。線蟲fat-1基因編碼的脂肪酸去飽和酶,可將n-6脂肪酸轉(zhuǎn)化為n-3脂肪酸,調(diào)和機(jī)體n-6/n-3比例。因此,fat-1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物將成為人類必需的n-3脂肪酸的重要來源。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備過程中由于目的基因整合位點(diǎn)隨機(jī)性,不利于目的基因的表達(dá)及調(diào)控,具有安全隱患。本研究將新型的鋅指核酸酶技術(shù)與傳統(tǒng)的同源重組打靶技術(shù)相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)hsfat-1基因在豬ROSA26位點(diǎn)的定點(diǎn)整合,提高了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性。具體研究內(nèi)容如下：1、本研究中將線蟲fat-1基因按照哺乳動(dòng)物密碼子使用偏好性進(jìn)行優(yōu)化并制備哺乳動(dòng)物表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞及G418篩選得到陽性克隆,在陽性克隆細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)添加脂肪酸去飽和酶作用底物花生四烯酸(Arachidonic Acid,AA),通過GC-MS定細(xì)胞中各脂肪酸含量間接評估脂肪酸去飽和酶將n-6脂肪酸轉(zhuǎn)化為n-3脂肪酸能力。結(jié)果表明...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
1 前言
    1.1 研究問題的由來
    1.2 fat-1基因研究進(jìn)展
    1.3 基因的定點(diǎn)整合研究進(jìn)展
        1.3.1 整合位點(diǎn)選擇
        1.3.2 目的基因座的定點(diǎn)切割
    1.4 目的基因的表達(dá)調(diào)控策略
    1.5 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備方法
        1.5.1 DNA顯微注射法
        1.5.2 慢轉(zhuǎn)錄病毒感染法
        1.5.3 精子載體法
        1.5.4 體細(xì)胞核移植
        1.5.5 轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移
        1.5.6 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞
    1.6 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用
        1.6.1 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器
        1.6.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型
        1.6.3 基因治療
        1.6.4 改造生物、培育新的生物品種
        1.6.5 器官移植
    1.7 本研究的目的意義
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 主要組織樣品
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器及耗材
        2.1.4 主要分析軟件及數(shù)據(jù)庫
    2.2 方法
        2.2.1 本研究的技術(shù)路線
        2.2.2 hsfat-1基因優(yōu)化合成
        2.2.3 hsfat-1基因功能驗(yàn)證
        2.2.4 豬ROSA26定點(diǎn)切割鋅指核酸酶(ZFNs)設(shè)計(jì)
        2.2.5 定點(diǎn)整合載體ROSA26-hsfat-1構(gòu)建及驗(yàn)證
        2.2.6 細(xì)胞篩選及鑒定
        2.2.7 重構(gòu)胚的制備與移植
3 結(jié)果
    3.1 hsfat-1基因優(yōu)化合成
    3.2 hsfat-1基因功能驗(yàn)證
        3.2.1 pcDNA3.1(+)hsfat-1質(zhì)粒提取及酶切鑒定
        3.2.2 pcDNA3.1(+)hsfat-1、pcDNA3.1(+)載體轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞
        3.2.3 hsfat-1陽性克隆去飽和酶功能驗(yàn)證
    3.3 豬ROSA26定點(diǎn)切割ZFNs預(yù)測結(jié)果
    3.4 定點(diǎn)整合載體ROSA26-hsfat-1構(gòu)建及細(xì)胞篩選
        3.4.1 定點(diǎn)整合載體ROSA26-hsfat-1構(gòu)建
        3.4.2 ROSA26-hsfat-1轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選
    3.5 重構(gòu)胚的制備與移植
        3.5.1 重構(gòu)胚的制備
        3.5.2 重構(gòu)胚的移植
4 討論
    4.1 關(guān)于hsfat-1基因編碼的脂肪酸去飽和酶的活性
    4.2 關(guān)于本研究基因打靶效率的討論
    4.3 單克隆細(xì)胞篩選的效率效率的問題
    4.4 關(guān)于篩選標(biāo)記基因的去除
5 小結(jié)
    5.1 本研究結(jié)論
    5.2 本研究創(chuàng)新點(diǎn)與特色
    5.3 本研究不足點(diǎn)與下一步工作建議
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號：3749571