本文關(guān)鍵詞：牛精子RNA對早期胚胎發(fā)育影響的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：最近研究顯示在受精過程中一些精子RNAs被帶入卵母細胞中,它們能保持穩(wěn)定至到胚胎基因組被激活的時期,這些研究暗示在受精過程中帶入的RNAs參與早期胚胎形成和(或)發(fā)育,對早期胚胎發(fā)育有重要的作用。由于精子特殊的外膜結(jié)構(gòu)及RNA含量極低等特點,高質(zhì)量的精子RNA提取一直是阻礙精子RNA深入研究的障礙之一。本實驗旨在優(yōu)化牛精子RNA的提取方法以及初步研究精子RNA對牛體細胞克隆胚早期發(fā)育的影響。本實驗優(yōu)化了傳統(tǒng)TRIzol提取精子RNA的方法,主要改進了三個實驗條件:即加TRIzol前加入適量的緩沖裂解液、提高TRIzol的裂解溫度(65℃)以及延長異丙醇的處理時間(2-3小時甚至過夜)。與傳統(tǒng)TRIzol法相比,改進的TRIzol法顯著改善了當精子濃度為×107時提取的總RNA產(chǎn)量(2,800 ng VS 2,9000 ng)和純度(OD260/2801.60 VS 1.88)。為了探索精子RNA對早期胚胎發(fā)育的影響,本試驗通過電融合方法將所提取的高純度和高濃度的RNA轉(zhuǎn)入核質(zhì)復(fù)合體中,分析精子RNA對體細胞克隆胚早期發(fā)育的影響。實驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)入精子RNAs后,囊胚內(nèi)總細胞數(shù)(104.45±5.24 VS 102.36±3.21,P0.05)相比對照組差異不顯著;但牛克隆胚胎卵裂率(86.3%±1.23%VS75.2%±1.57%,P0.05)、囊胚率(35.8%±0.87%VS 28.6%±1.10%,P0.05)顯著提高而胚胎凋亡率(2.8%±0.23%VS 5.8%±0.11%,P0.05)顯著降低。干性基因OCT4、SOX2在囊胚中的表達量顯著高于對照組(P0.05)。本實驗優(yōu)化了牛精子RNA的提取方法,通過體細胞克隆胚精子RNA電融合實驗初步表明其對早期胚胎發(fā)育具有重要的影響,為進一步探索精子RNA對早期胚胎的發(fā)育調(diào)控,及提高體細胞克隆效率做了鋪墊。
【關(guān)鍵詞】：精子RNA 克隆胚胎 早期發(fā)育 牛
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-11
• 文獻綜述11-20
• 第一章 精子RNA研究進展11-20
• 1.1 精子細胞形成過程11-12
• 1.2 精子形成期間的RNA轉(zhuǎn)錄、儲存和傳遞12-13
• 1.3 成熟精子中的mRNA及其功能13-15
• 1.3.1 成熟精子中mRNA的研究概況13-14
• 1.3.2 成熟精子中mRNA在受精后卵母細胞中的作用14
• 1.3.3 成熟精子中mRNA的潛在功能14-15
• 1.4 成熟精子中干擾RNA及其功能15-16
• 1.5 成熟精子中無意義RNA的研究16-17
• 1.6 精子攜帶的外源RNA及其功能17-18
• 1.7 精子RNA在胚胎發(fā)育過程中的作用18-20
• 實驗部分20-45
• 第二章 牛成熟精子RNA的提取與鑒定20-33
• 2.1 材料與試劑20-22
• 2.1.1 實驗材料20
• 2.1.2 主要試劑及配制20-21
• 2.1.3 實驗儀器設(shè)備21-22
• 2.2 實驗方法22-26
• 2.2.1 牛附睪和睪丸的采集22
• 2.2.2 精子提取與收集22
• 2.2.3 精子質(zhì)量的鑒定22-23
• 2.2.4 精子總RNA的提取23-24
• 2.2.5 睪丸總RNA的提取24
• 2.2.6 總RNA的純化24
• 2.2.7 精子及睪丸總RNA的反轉(zhuǎn)錄24-25
• 2.2.8 總RNA質(zhì)量鑒定25-26
• 2.3 結(jié)果26-31
• 2.3.1 精子純度分析26-28
• 2.3.2 提取RNA的最佳精子濃度的篩選28-29
• 2.3.3 不同提取方式對精子RNA質(zhì)量的影響分析29-30
• 2.3.4 不同提取方式對睪丸組織RNA質(zhì)量的影響分析30-31
• 2.4 討論31
• 2.5 小結(jié)31-33
• 第三章 精子RNA對早期胚胎發(fā)育影響的初步研究33-45
• 3.1 材料與試劑33-35
• 3.1.1 實驗材料33
• 3.1.2 儀器設(shè)備33-34
• 3.1.3 主要試劑及配置34-35
• 3.2 實驗方法35-39
• 3.2.1 供體細胞的準備35
• 3.2.2 卵母細胞的收集和體外成熟35
• 3.2.3 重構(gòu)胚的構(gòu)建35-36
• 3.2.4 電融合36
• 3.2.5 重構(gòu)胚的激活和體外培養(yǎng)36
• 3.2.6 體外受精及胚胎的培養(yǎng)36-37
• 3.2.7 囊胚細胞計數(shù)37
• 3.2.8 囊胚凋亡染色37-38
• 3.2.9 胚胎cDNA制備38
• 3.2.10 定量PCR檢測分析38-39
• 3.3 結(jié)果39-43
• 3.3.1 向卵母細胞中電融合精子RNA的最佳濃度的篩選39-40
• 3.3.2 精子RNA處理對SCNT卵裂率和囊胚率的影響40-41
• 3.3.3 精子RNA處理對SCNT囊胚凋亡的影響41
• 3.3.4 精子RNA處理對體細胞核移植囊胚發(fā)育相關(guān)基因表達的影響41-43
• 3.4 討論43-44
• 3.5 小結(jié)44-45
• 全文結(jié)論45-46
• 參考文獻46-51
• 致謝51-52
• 作者簡介52

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